Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii část II Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Imunologie - Stanovení stavu imunitního systému • Vrozené nebo získané imunodeficience - monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity terapie - monitorování efektivity imunosupresivní terapie u transplantovaných pacientů • Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie • diagnostice alergických onemocnění Hematologie • Diagnóza maligních onemocnění • Stanovení funkčních vlastností trombocytů Funkční testy - Aktivace lymfocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů - Aktivace fagocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného fagocytu) mikrobicidní aktivita Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita Tvorba oxidu dusnatého - Diagnostice alergických onemocnění - Stanovení funkčních vlastností trombocytů Změna povrchové exprese antigenu (receptoru) Příklady: - CD25, CD69, HLA-DR - aktivace lymfocytů -CD11b - aktivace polymorfonukleárních granulocytů a monocytů -CD62P - aktivace krevních destiček Změna povrchové exprese antigenu charakteristického pro aktivovaný stav dané buněčné subpopulace. Antigenem je většinou receptor spojený s funkcí toho určitého typu buněk Neutrofily Monocyty Lymfocyty SideScatter Forward Light Scatter 0 200 400 600 800 1000 02004006008001000 SS a FS leukocytů získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů Změna povrchové exprese antigenu (receptoru) u lymfocytů Např. současně s imunofenotypizací v programu Simulset jako krok č. 7 Stanovení aktivace T-lymfocytů http://clip.lf2.cuni.cz/cs/prezentace-ke-stazeni/ Detekce fyziologických fagocytů - Změna povrchové exprese antigenu (receptoru) u fagocytů - Produkce volných radikálů fagocyty (detekce chronické granulomatózní choroby) - Stanovení fagocytární aktivity (detekce poruch fagocytovat patogeny) CD11b 600 700 800 900 1000 1100 1200 before initiation of CPB end of CPB 30 min after 4 hours reper. 24 hours MRF * * * * 50 70 90 110 130 150 170 before initiation of CPB end of CPB 30 min after 4 hours reper. 24 hours MRF * * * * CD62L Aktivace neutrofilních granulocytů během otevřené operace srdce Stanovení aktivace granulocytů v periferní cirkulaci s využitím detekce povrchové exprese CD11b a CD62L Identifikace a funkční analýza subpopulací makrofágů a neutrofilů • patologické procesy a choroby jsou spojeny s výskytem konkrétních regulačních populací imunitních buněk – identifikace buněčných subpopulací pomocí FC – funkční analýza • zlepšení a standardizaci diagnostiky různých onemocnění spjatých s jednotlivými subpopulacemi regulačních monocytů/makrofágů a neutrofilů Identifikace a funkční analýza subpopulací makrofágů a neutrofilů Scapini et al, 2016 Imunoregulační neutrofily Experimental setting Neutrophil Immunophenotype Maturation/activation status Functional properties and immunosuppression mechanism Solid tumors Pancreas, colon, and breast CD15+ cells Mature, activated cells Contact-dependent inhibition of IFNγ production by T cells via H2O2 release Renal carcinoma CD15+ CD11b+ CD66bhigh VEGFR1+ CD62Llow CD1 6low cells Mature activated cells Inhibition of proliferation and IFNγ production by T cells, likely via Arg1 release Non-small cell lung cancer (NSCLC) CD15+ CD11b+ CD33low CD14− IL-4R+ IFNγR+ cells Not reported Suppression of CD3ζ expression in CD8+ T lymphocytes Glioblastoma CD15+ CD66b+ CD11b+ CD33low CD14− HLA-DR− cells Mature activated cells Inhibition of proliferation and IFNγ production by T cells via Arg1 release Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), urologic and lung cancer CD66b+ CD33low HLADR− CD125− CD11b+/− C D16+/− CXCR1low CXCR2l ow CXCR4+ cells Heterogeneous with several immature cells Reduced apoptosis, ROS production and chemotaxis; inhibition of proliferation and IFNγ production by T cells Scapini et al, 2016 Imunosupresivní neutrofily Detekce volných radikálů Oxidativní vzplanutí fagocytů Phagosome O2 O2 - H2O2 NADPH + H+ NADP+ HMP NADPH Oxidase GSSG GSH GR GP SOD O2 - H + Catalase H2O + O2 SO D Stimulant PKC(PMA) Lipid Peroxidation Phospolipase A2 activity H2O2 H2O H2O2 + O2 - OH. Leukotrienes • dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and derivatives • dihydroethidine (HE) • dihydrorhodamine 123 (DHR 123) and dihydrorhodamine 6G • dihydrocalcein AM • Amplex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) • 3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF) and 3'-(p-hydroxyphenyl) fluorescein (HPF) • (pentafluorobenzoyl)aminofluorescein diacetate (PFB-H2FDA) • MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator • MitoTracker Orange (CM-H2TMRos) and MitoTracker Red (CM- H2XRos) Fluorescenční próby pro detekci volných radikálů DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OHHO Cl O COOH H Cl OHO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log green (FITC) fluorescence . 1 1000100101 0 20 40 60 counts PMA-stimulated PMNControl 80 Hydroethidine HE EB N CH2CH3 NH2H2N H Br- N CH2CH3 NH2H2N + O2 - NADPH NADP O2 NADPH Oxidase O2 - EB EB HEEthidium bromide J.P. Robinson et al. 1998 http://www.cyto.purdue.edu/ log red Fluorescence .1 1000100101 0 20 40 60 counts PMA-stimulated PMNControl 80 Fluorescent Exc. 488 Em. 600 Dihydrhodamine 123 O NH2H2N C OCH3 O O NH2H2N C OCH3 O H2O2 Dihydrhodamine 123 Rhodamine 123 3'-(p-hydroxyphenyl) fluorescein (HPF) a 3'-(p-aminophenyl) fluorescein (APF) AFP - detekce kyseliny chlorné HFP / AFP - detekce hydroxylových radikálů Srovnání specificity APF, HPF, and H2DCFDA ROS APF HPF H2DCFDA Hydrogen peroxide (H2O2) <1 2 190 Hydroxyl radical (HO·) 1200 730 7400 Hypochlorite anion (–OCl) 3600 6 86 Nitric oxide (NO) <1 6 150 Peroxyl radical (ROO·) 2 17 710 Peroxynitrite anion (ONOO–) 560 120 6600 Singlet oxygen (1O2) 9 5 26 Superoxide anion (·O2–) 6 8 67 Autooxidation -exposure to fluorescent light <1 <1 2000 Detekce fagocytární aktivity s využitím FITC • Pohlcení fluorescenčně značených částic (např. latexové částice, zymosanové částice, obarvené baktérie) • Opsonizace částice – porovnání s neopsonizovanou částicí udává informaci o expresy a funkčnosti opsoninových receptorů Postup: • Značení částice fluorescenční próbou • Opsonizace částic vybranými opsoníny (např. IgG, C3) nebo kompletním sérem daného druhu • Izolované leukocyty jsou inkubovány dohromady s částicemi při teplotě fyziologické pro daný druh FITC-Labeled Bacteria J Paul Robinson 1998 FITC-Labeled Bacteria • Rozlišení pohlcení částice do uzavřeného fagozómu od adherence na povrch fagocytu – aplikace trypanové modři (neprostupuje do živých buněk), která má zhášecí vlastnosti pro FITC J Paul Robinson 1998 Detekce fagocytární aktivity s využitím buněk exprimujících fluorescenční proteiny Obdobný princip jako u fluorescenčně značených Výhody bez potřeby baktérie nebo buňky určené k fagocytóze barvit fluorescenční značkou Nevýhody Není možné určit mezi buňkou která je plně pohlecena nebo jenom na povrchu fagocytu Ztráta signálu z fluorescenčního proteinu (např. GFP) díky jeho degradaci ve fagozómu Jamie Schwartz et al. J Immunol 2009;183:2632 Degradace GFP ve fagozómu Usmrcování bakterií nebo buněk exprimujících fluorescenční proteiny (např. GFP) - degradace i těchto proteinů a postupná ztráta fluorescenčního signálu Nevýhoda: Falešně negativní data při detekci fagocytózy Využití: pro stanovení relativní viability bakterií ve fagozómu Detekce fagocytózy pomocí pHrodo-succinimidyl ester • Nefluorescenční pHrodo se změní na fluorescenční při změně pH, ke které dochází ve fagozómu • Detekce pouze plně pohlcených částic či buněk Fluorescenční emisní spektra pHrodo™ barvených E. coli v pufrech pH od 4 do 10. Detekce fagocytózy pomocí pHrodo-succinimidyl ester Detekce fagocytózy pHrodo značených latexové částic, zymosanových částice, obarvených baktérií. Nestimulovaná kontrola Buňky stimulované pHrodo barvenými latex. částicemi Detekce fagocytózy s využitím pHrodo-SE Detekce pohlcení (fagocytózy) apoptických buněk, které byly označené pHrodosuccinimidyl ester (SE) Makrofágy pohlcující apoptické buňky Značené apoptické buňky 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2 diacetate) 4-amino-5-methylamino- 2',7'- difluorofluorescein (DAF-FM diacetate) DAF-FM-DA DAF-FM-DA DAF-FM DAF NO esterasis Exc. 495nm Em. 515nm Endothelial cell Detekce produkce oxidu dusnatého (NO) cis-Paranaric Acid BODIPY 665/667 BODIPY581/591 C11 Detekce lipidové peroxidace C C C C C C C C H C H3CH2 H H H (C H2)7CO O H HH H H Oxidace lipidové detekční látky spojena s nárůstem nebo spektrální změnou fluorescence Detekce intracelulární produkce cytokinů - Charakterizace různých subpopulací leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce cytokinů - Charakterizace funkčních vlastností buněk odpověď na vybraný stimul 1. Stimulate whole blood or PBMC + Brefeldin A 2. Lyse/Fix Wash 3. Permeabilize Wash 4. Stain Wash 5. Flow cytometry CD69PE anti-IFNγ FITC BD FastImmune TM Cytokine Flow Cytometry Protocol 1.0% 6 h Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění Diagnostika alergií a hypersensitivit o Kožní testy (Prick test, Epikutánní testy) o Provokační testy (oční-spojivkový, nosní, bronchiální) o Krevní testy - vyšetření specifických IgE (CAST ELISA, microarray, průtoková cytometrie - Test aktivace bazofilů (BAT) • Výsledek neadekvátní reakce na neškodné vnější alergeny • Alergen - jakýkoliv Ag schopný vyvolat alergickou odpověď • Reakce typu I-IV • Nejčastější je reakce typu I - spojena s tvorbou IgE proti alergenům zevního prostředí Test aktivace bazofilů • in-vitro test založen na sledování znaků objevujících se po aktivaci bazofilů alergenem ⇨ CD63, CD203c Alergen Pozitivní nález Inhalační alergeny > 15 % Potraviny > 15 % Latex > 15 % Hmyzí jedy > 10 % Léky > 5 % Acylpyrin > 5 % Pozitivní kontrola (anti IgE) > 15 %  Výsledkem - % aktivovaných bazofilů  BASOTEST®, FlowCAST®, CAST®-COMBI Honzová, S. Interní medicína pro praxi 11(4), 168-170 (2009) Sanz, M.L. et al, Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 391-402 (2007) BASOTEST® o Plná krev odebrána do heparinu, inkubována se stimulačním pufrem (10 min/37˚C) ⇨ inkubace s alergenem (20 min/37˚C) o Pozitivní kontrola – fMLP o Aktivace bazofilních granulocytů indukuje fúzi granulí a uvolňování zánětlivých mediátorů ⇨ proces degranulace zastaven inkubací vzorku na ledu o Buňky jsou značeny - monoklonální protilátka anti-IgE-PE - monoklonální protilátka anti-CD63-FITC (anti-gp53-FITC) (rozpozná CD63 (gp53) na povrchu aktivovaných bazofilů) o Lýze erytrocytů ⇨ promytí ⇨ procento aktivovaných bazofilů určeno pomocí průtokového cytometru BASOTEST® 2,6% aktivovaných bazofilů negativní kontrola (1.8-9.5%) 29,5% aktivovaných bazofilů pozitivní kontrola (25.2.-100%) 95,1% aktivovaných bazofilů vzorek Basotest (BAT) - shrnutí o Patří mezi méně často používané vyšetřovací metody (pouze při diagnostických nejasnostech ) o BAT má vyšší senzitivitu než široce užívané vyšetření specifických IgE a poměrně vysokou specificitu o Možnost využití při diagnostice alergií na pyly, potraviny, hmyzí jedy, léky Krevní destičky (trombocyty) • Imunofenotypizace receptorů krevních destiček Určení vrozených poruch, stavu aktivace destiček in vivo a aktivovatelnost destiček • Detekce a charakterizace prokoagulačních mikročásteček derivovaných z krevních destiček Imunofenotypizace receptorů trombocytů - Stanovení fenotypu (stavu destiček v čerstvě odebraném vzorku) - Zhodnocení reaktivity destiček jako odpověď na agonistu • Stanovení receptorů klidových destiček jako jsou GPIIbIIIa (CD41, CD61) GPIb-IX-V (CD42a, CD42b, CD42d) • Aktivované exprese - P-selektinu (CD62P) nebo PAC1 Určení prokoagulačních mikročásteček - Derivované z trombocytů po jejich aktivaci • Určení díky navázání annexinu V nebo protilátek specifických pro koagulační faktory V/Va nebo X/Xa • Zhodnocení schopnosti destiček vytvářet mikročástečky Průtoková cytometrie Defekty trombocytů • Bernard – Soulierův syndrom - absence komplexu GPIb-IX-V - projevy: mírná trombocytopenie zvětšení krevních destiček absence agregace destiček - určení pomocí anti-CD 41 nebo anti-CD 61 Defekty trombocytů • Glanzmannova trombastenie - autosomálně recesivní porucha - defekt integrinu komplexu GPIIb-IIIa - projevy: delší čas krvácení (fibrinogen nespustí dominový efekt destiček) pomalé rozpouštění sraženiny - určení pomocí anti-CD42a nebo anti-CD42b Experimentální studie sledující vazbu myeloperoxidázy (MPO) na trombocyty a vliv na jejich aktivaci MPO localization on human thrombocytes - MPO Control (- Anti- MPO Ab) + MPO Anti-MPO Ab Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Detekce navázané MPO na povrch destiček průtokovým cytomerem Detekce aktivovaných stresových vláken F-aktinu v destičkách – znak aktivace Detekce CD62P (P-selectin) and CD31 (PECAM-1) na povrchu destiček – znak aktivace Detekce agregátů destiček s polymorfonukleárními granulocyty Úskalí detekce vlastností a funkcí destiček pomocí průtokové cytometrie • Zpracování vzorků krve do 30 minut • Použití dostatečně široké jehly • Nepoužívat jako antikouagulant EDTA a heparin • Fixace formalinem pro lepší rozpoznávání protilátkami (x PAC1) • Prokoagulační částečky často vykazují intenzivní autofluorescenci • Při použití trombinu nutné přidat CaCl2 • Imunofenotypizace • Funkční testy Změna exprese vybraných povrchových markrů Produkce cytokinů Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita Tvorba oxidu dusnatého Lipidová peroxidace Aktivace bazofilů Stanovení funkčních vlastností trombocytů Shrnutí přednášky příklady aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii