Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Imunologie - Stanovení stavu imunitního systému • Vrozené nebo získané imunodeficience - monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity terapie - monitorování efektivity imunosupresivní terapie u transplantovaných pacientů • Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie Hematologie • Diagnóza maligních onemocnění • Stanovení funkčních vlastností trombocytů Metodologické přístupy • Imunofenotypizace Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytů (obecně krevních elementů v krvi, kostní dřeni nebo mozkomíšním moku) • Funkční testy - Aktivace lymfocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů - Aktivace fagocytů (mikrobicidní aktivita) Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita - Stanovení funkčních vlastností trombocytů Imunofenotypizace • Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací buněk (primárně leukocytů) na základě exprese vybraných povrchových antigenů případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a expresí intracelulárních antigenů CD2CD4 Imunofenotypizace leukocytů • Na základě rozptylu světla jsou leukocytární populace rozděleny podle velikosti a granularity • Specifické monoklonální protilátky označené různými fluorochromy proti vybraným CD antigenům umožňující rozdělení buněk do populací CD Antigeny • Systém označení povrchových molekul leukocyte (buněk) mající stejný epitop, identifikovatelný stejnou protilátkou umožňující rozpoznávání buněčných populací při imunofenotypizaci • Většina má alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře buňky • Dodnes definovány CD1 přes CD370 Human Leukocyte Differentiation Antigen Workshops (poslední X. ve Wollongong 2014, definice CD 365-371) •Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul, a jednotlivé molekuly se označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E) • Zdroj informací o CD nomeklatuře – učebnice imunologie, web stránky např. http://www.sciencegateway.org/resources/prow/index.html http://www.pathologyoutlines.com/cdmarkers.html Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Kmenová buňka CD34 Časný pro-B lymf. CD34; CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38 Pozdní pro-B lymf. CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38; CD20; CD40 Velký pre-B lymf. CD45R; IL-7R; CD19; CD38; CD20; CD25 (rec. IL-2); CD40 Malý pre-B lymf. CD45R; CD19; CD38; CD20; CD40 Exprese vybraných povrchových znaků během vývoje B lymfocytů Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Nezralý B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD40 Zralý naivní B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Lymfoblast CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Paměťová buňka CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Plasmatická buňka CD135; CD38 Nezralé CD3-(jen v cytoplasmě)4-8dvakrát-negativní tymocyty pTα:β+ CD3+ 4+ 8+ velké dvakrát-pozitivní tymocyty γ:δ+ CD3+ 4- 8α:β+ CD3+ 4+ 8+ malé klidové dvakrátpozitivní tymocyty α:β+CD3+4+8- α:β+CD3+4-8+ malé jedenkrát-pozitivní tymocyty Export do periferie Vývoj T-lymfocytů Možné rozdělení jednotlivých subpopulací lymfocytů podle exprese vybraných povrchových antigenů Lymphocytesin Blood B cells T cells NK cells TH (CD4+) TC/S (CD8+) γδ T cells CD5+ CD5– CD4–CD8– CD16+CD56– CD16+CD56+ CD16–CD56+ Vδ2 Vδ1 Naive M emory NaiveM emory Vγ9+ Vγ9– CD23+ CD23– CD45RB+ CD45RB– CD11a+ CD11a– CD45RA+ CD57+ CD57– CD60+ CD60– CD60+ CD60– CD11a+ CD11a– CD45RA+ CD57+ CD57– CD60+ CD60– CD60+ CD60– CD8dim CD4+ CD4– Vybrané povrchové molekuly charakteristické pro různé typy leukocytů (“markery” jednotlivých typů) Buněčný typ Charakteristické povrchové molekuly Leukocyty (všechny) CD53, CD45, CD43 Hematopoetické prekurz. CD34, CD117, CD137 T lymfocyty CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD27, CD28, CD96, TCR T pomocné l. (Th) CD4 T cytotoxické l. (Tc) CD8 B lymfocyty CD19, CD20, CD22, CD37, CD39, CD40, CD79, BCR Pre-B lymfocyty CD9, CD10, CD138 Plasmatické buňky CD28, CD138 NK lymfocyty CD2, CD11b, CD16b, CD56, CD57, CD94, CD158 Neutrofilní granulocyty CD11b, CD15, CD87 Monocyty CD14, CD33, CD64, CD87, CD89 Dendritické buňky CD83, CD86, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209 E Ab1 Ab2 Možnosti exprese antigenů u vybraných buněčných populací A Ab1 Ab2 B Ab1 Ab2 C Ab1 Ab2 D Ab1 Ab2 Izotypová kontrola Monoklonální protilátky stejné třídy proti irelevantním antigenům CD45 Všechny leukocyty, lymfocyty silněji CD14 Monocyty CD3 Všechny T lymfocyty CD19 Všechny B lymfocyty CD4 Pomocný T lymfocyt CD8 Cytotoxický T lymfocyt CD56 NK lymfocyt Příklad výběru detekovaných antigenů pro určení zastoupení a počtu jednotlivých subpopulací lymfocytů v periferní krvi Příklad kombinace jednotlivých protilátek při použití dvojího značení Zkumav- ka FITC PE Stanovení 1 CD45 CD14 %lymfocytů v ohraničení (gate) pro lymfocyty 2 Iz.kont. Iz. kont. Nespecifická vazba – autofluorescence 3 CD3 CD4 Pomocné (Th) lymfocyty 4 CD3 CD8 Cytotoxické (Tc) lymfocyty 5 CD3 CD19 Celkové B- lymfocyty 6 CD3 CD56 NK buňky Neutrofily Monocyty Lymfocyty SideScatter Forward Light Scatter 0 200 400 600 800 1000 02004006008001000 SS a FS leukocytů získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů Kontrola “čistoty” lymfocytárního ohraničení na základě FS a SS CD45 FITC (log) R1=monocyty (CD14+) R2=lymphocyty (CD45>monocyty) R3=granulocyty (CD45 101102103104 Anti-TCR-gamma-delta-1PE--> CD8 CD4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Side Scatter --> 101102103104 Anti-TCR-alpha-beta-1FITC--> CD3 SIDE SCATTER RPCI LFC CD3 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 --> 101102103104 CD8--> CD8 CD3-CD4- CD3-CD4+ CD3-CD8+ CD3+CD4+ Th lymf CD3+CD8+ Tc lymf CD3+CD4- 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 --> 101102103104 CD4--> CD3 CD4 10 1 10 2 10 3 10 4 CD8 --> 101102103104 CD4--> CD8 CD4 RPCI LFC Kombinace grafů - tříbarevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8 Čtyř barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8, CD56 Čtyřbarevná imunofenotypizace 1. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD4APC, CD8PE 2. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD19APC, CD16+56PE Výsledný report Výsledný report Příklad osmi barevná imunofenotypizace Příklad 17 barevná imunofenotypizace Hematologie Použití imunofenoptypizace pro detekci hematologických onemocnění • Stanovení zastoupení jednotlivých buněčných linií • Stanovení stupně diferenciace • Stanovení monoklonální populace (B-lymfocyty) Granulocytes granulocytes Hematopoéza CD34+ CD13- (CD36+) CD34+ CD13+ CD115+ CD34+ CD13+ CD115- CD34+ CD13- CD36- CD115 FSC erythroid monoblasts myeloblasts 26.6 39.6 Příklad identifikace buněk myeloidních linií CD45 Human Leukocytes CD3 Pan T Lymphocytes CD5 Pan T Lymphocytes CD7 Pan T Lymphocytes CD4 T-helper Lymphocytes CD8 T-suppressor/cytotoxic Lymphocytes CD10 B-cells CD19 Pan B-cells CD20 Mature B-cells FMC7 Activated B-cells CD23 Activated B-cells CD38 Plasma cells, activated T-cells CD103 T and B Lymphocytes CD11c T and B cells, NK cells, monocytes CD25 Activated B-cells CD22 B-cells Kappa Light chains Lambda Light chains Příklad panelu CD antigenů stanovovaných při detekci lymfomů CD45 Human Leukocytes CD5 Pan T Lymphocytes CD10 B Lymphocytes CD19 Pan B Lymphocytes CD20 Mature B Lymphocytes HLA-DR (I3) Activated T and B Lymphocytes CD34 Progenitor Cell CD117 Progenitor Cell CD15 Monocytes/Granulocytes CD33 Myelocyte/Monocyte CD56 Natural Killer Cells CD14 Monocyte CD13 Myelocyte/Monocyte CD64 Monocytes cMPO Myeloperoxidase c79a B Cells C3 Cytoplasmic CD3 T Cells cTDT Immature Lymphocytes/thymocytes Příklad panelu CD antigenů stanovovaných při detekci leukemií Detekce intracelulární produkce cytokinů - Charakterizace různých subpopulací leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce cytokinů - Charakterizace funkčních vlastností buněk odpověď na vybraný stimul Diferenciace pomocných T-lymfocytů (CD4+ T-lymfocyty; Th lymfocyty) 1. Stimulate whole blood or PBMC + Brefeldin A 2. Lyse/Fix Wash 3. Permeabilize Wash 4. Stain Wash 5. Flow cytometry CD69PE anti-IFNγ FITC BD FastImmuneTM Cytokine Flow Cytometry Protocol 1.0% 6 h Funkční testy Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Produkce volných radikálů fagocyty Detekce oxidu dusnatého Fagocytární aktivita Stanovení funkčních vlastností trombocytů Pokračování druhé části přednášky Příklady aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii