Aktivace lymfocytů v klinické laboratoři
Veronika Kanderová
CLIP (Childhood Leukaemia Investigation Prague) - Cytometrie
Klinika dětské hematologie a onkologie
2. LF UK a FN v Motole
Přednáška zazněla na edukační sekci Klinická cytometrie
v rámci konference ČSAC 2017 a doporučení z ní plynoucí
není oficiálním doporučením ČSAC.
Disclaimer
Proč?
Detekce T-lymfocytární aktivace je jedním z klíčových vyšetření
v laboratořích klinické imunologie/hemato-onkologie.
Výsledky se platňují
v transplantologii (akutní rejekce)
u infektů (virových, bakteriálních, …)
u autoimunitních onemocnění
u hemofagocytujících onemocnění (HLH)
v onkologii
můžou vypovídat o geneticky podmíněné (nebo jinak ovlivněné)
imunitní nedostatečnosti (primární a sekundární imunodeficity)
Nejčastěji se hodnotí aktivace T-lymfocytů
(v některých případech i B-lymfocytů a NK buněk)
Čím a jak aktivovat T-lymfocyty?
LEKTINY : vazba na glykoproteiny/glykolipidy
phytohemagglutinin (PHA) (Fazole zahradní)
concanavalin A (ConA) (Jack Bean)
pokeweed mitogen (PWM) (Líčidlo americké)
BAKTERIÁLNÍ TOXINY (superantigeny)
staphylococcal enterotoxin A, B (SEA, SEB)
CHEMICKÉ KOMPONENTY
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)
Ionomycin
PROTILÁTKY
anti-CD3 (+ anti-CD28 + anti-CD49d)
klony OKT3, UCHT1, aj.
klon MEM-57 + FastImmune CD28/CD49d
MEM-57 adsorbovaný na povrchu mikrotitrační destičky + solubilní CD28/CD49d
anti-CD3/28 beads (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28)
buňky : kuličky = 1 : 1
CYTOKINY Inflammatory Cytokines as a Third Signal for T Cell Activation, Curr Opin Immunol. 2010
https://www.slideshare.net/GinnieHench/apc-tcell-stimulation-animation
3 typy lymfocytárních aktivačních testů :
1) Detekce povrchových aktivačních znaků.
2) Stanovení schopnosti proliferovat in vitro.
3) Diferenciace a produkce cytokinů.
Čím a jak aktivovat T-lymfocyty?
SPECIFICKÉ ANTIGENY : vazba na HLA antigeny APC
Candida albicans antigen
PPD (tuberculin, Mycobacterium tuberculosis)
Streptokinase-streptodornase (Streptococcus)
CMV peptidy, EBV peptidy …
! nutno mít v kultuře živé monocyty a DCs (PBMCs) !
→ aktivace (CD40L), proliferace, produkce cytokinů (IFNγ, IL-2, …)
Kinetika exprese aktivačních molekul
FastImmune Assay (BD Biosciences)
Resting T-cell
CD69
C-Type Lectin
Early Lymphocyte Activation Ag
2-8h
Early-activated T-cell Late-activated T-cell
CD25 (IL2R)
HLA-DR
DNA syntéza
3-10 dní
CD71
Transferrin receptor
24-48h
CD25
IL2RA
CD95
FAS
24-48h
CD38
<24h
Larbi and Fulop, From “truly naïve” to “exhausted senescent” T cells: When markers predict
functionality. Cytometry A 2013
Quarona et al., CD38 and CD157: A long journey from activation markers to multifunctional
molecules. Cytometry B 2013
Shipkova, et al., Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation.
Clin Chim Acta 2012
Chattopadhyay and Roederer, Good Cell, Bad Cell: Flow Cytometry Reveals T-cell Subsets
Important in HIV Disease. Cytometry A 2010
Reddy M, et al., Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and
cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures:
an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods 2004
Caruso et al., Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their
correlation with cell proliferation. Cytometry 1997
Biselli R, et al., Multiparametric flow cytometric analysis of the kinetics of surface molecule
expression after polyclonal activation of human peripheral blood T lymphocytes. Scand J
Immunol 1992.
Kde najít radu?
Stanovení HLA-DR na T-lymfocytech
Pacific Blue
Klon Immu-357
Pacific Blue
Klon L243
PerCP-Cy5.5
Klon L243
Stanovení HLA-DR na T-lymfocytech
klon Immu-357 : dává nám mírně odlišná %, ale je spolehlivý
klon L243: současný „zlatý standard“ v IVD testech
Stanovení HLA-DR na T-lymfocytech
Doporučení:
1) Zjistěte si klon (+ fluorochrom + firmu), který používáte
2) Zjistěte, jakým klonem (a od které firmy) byla měřena referenční data, ke kterým
vaše výsledky vztahujete
2014, HLA-DR PE (BD) 2008, HLA-DR FITC Immu-357
2009, HLA-DR FITC L243 1997, HLA-DR L243
Čím a jak aktivovat B-lymfocyty?
LEKTINY : vazba na glykoproteiny/glykolipidy
pokeweed mitogen (PWM)
LIGANDY TLR
CpG - vazba na TLR9
PROTILÁTKY a REKOMBINANTNÍ PROTEINY
anti-IgM (+ CD40L/anti-CD40)
anti-IgD (+ CD40L/anti-CD40)
CYTOKINY IL-21, IL-4, IL-10 aj.
CD69, CD25, CD23, CD80, CD86, diferenciace
produkce protilátek, cytokinů, …
Další specializované aktivační testy
DEGRANULACE NK buněk
Chiang et al., Comparison of primary human cytotoxic T-cell and natural killer cell
responses reveal similar molecular requirements for lytic granule exocytosis but
differences in cytokine production. Blood 2013
Bryceson et al., Functional Analysis of Human NK cells by Flow Cytometry.
Methods Mol Biol 2010
NK AKTIVACE/EXPANZE
přes NKp46 and NKp30 receptory nebo kombinací cytokinů IL-2, IL-12, and IL-15
INDUKCE APOPTÓZY
SIGNALIZAČNÍ PROCESY
PRODUKCE CYTOKINŮ …
veronika.kanderova@lfmotol.cuni.cz
Poděkování za pomoc a konzultaci
Pavla Luknárová Marcela Vlková Miro BenkoJolana Vosáhlová