Biokatalyzátory – enzymy, RNA > F15-07.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: •konstitutivní •inducibilní •bez vedlejších produktů Bio- versus chemokatalyzátory + •Vyšší reakční rychlostí • •Mírnější podmínky • N2 + 3H2 → 2NH3 •Haber-Boschova syntesa •Fe 450 oC 20 MPa •Nitrogenasa •pH 7 normální tlak a teplota ATP Bio- versus chemokatalyzátory + •Vyšší reakční rychlostí • •Mírnější podmínky • •Vyšší specifita – typ reakce a typ substrátu • •Schopnost regulace Bio- versus chemokatalyzátory - • •Citlivost vůči řadě vlivů a menší stabilita Biokatalyzátory •Globulární bílkoviny – enzymy • •RNA – ribozymy Cech Altmann NC1986 • Enzymy – molekulární stroje • 2 H2O2 O2 + 2H2O • •Rychlostní konstanta : ØBez katalýzy - 0,23 s-1 ØPt - 1,3 . 103 s-1 ØEnzym - katalasa - 3,7 . 107 s-1 Enzymy – molekulární stroje figure 5-01 •0 •Pt •Katalasa Enzymy – molekulární stroje •Katalasa • •2 H2O2 O2 + 2H2O • •Číslo přeměny 40 000 000 • • • • 1 molekula enzymu přemění 40 000 000 molekul substrátu za 1 s File:PDB 7cat EBI.jpg Typy reakcí •jednoduché •Katalasa • •2 H2O2 O2 + 2H2O •složité •DNA polymerasa •Počátky biochemie – fermentace a trávení Názvosloví - asa - áza - - Jednotně v celé práci ! •Synthasy •Syntethasy table 5-2 part 1 table 5-2 part 2 •http://www.brenda-enzymes.info/ Enzyme Database - BRENDA - Windows Internet Explorer Escherichia coli Homo sapiens 3 000 bílkovin 25 000 bílkovin 101_0198 Enzymy – stanovení koncentrace e Koncentrace ↔ Katalytická aktivita Substrát « Produkt • nBiochemie nMolekulární biologie n nKlinická diagnostika nFarmakologie – vývoj léčiv nBiotechnologické procesy nBioanalytická chemie • • • Stanovení aktivity enzymů Metody používané pro stanovení aktivity enzymů •Spektrofotometrické •Spektrofluorimetrické •Elektrochemické •Radiochemické •Separační – HPLC, GC, CE • Enzyme Assays R.Eisenthal and M.J. Danson C:\Documents and Settings\arcturus\Dokumenty\Piešťany\0978019963820_500X500.jpg HPLC in Enzymatic Analysis E.F. Rossomando http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/03/04711034/0471103403.jpg •mikrokatal (μkat) = 10-6 kat •nanokatal (nkat) = 10-9 kat •pikokatal (pkat) = 10-12 kat •1 IU = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat •60 % table 6-2 •ADH •LDH • •Dýchací řetězec • Vitamín C •absence L-gulonolaktonoxidasové aktivity table 6-1 part 1 •Kyselina nikotinová B3 •Vitamíny rozpustné ve vodě table 6-1 part 2 table 6-1 part 3 table 6-1 part 4 •Vitamíny rozpustné v tucích •procesy vidění •metabolismus Ca a P •křivice •antioxidant •procesy srážení krve •1906 •Katalytická •část •Vazebná •část •Vazebná •část •H- •enzymová •bílkovina Warburgův optický test •∆ 340 nm •+ A340 nm •Přímé stanovení • • •Pomocná reakce • • •+ A340 nm •- A340nm •Katalytická •část •Vazebná •část •Vazebná •část •Energetická role •Biosyntetická role •Katalytická •část •Vazebná •část •Katalytická •část •Vazebná •část •FAD (FMN) « FADH2 (FMNH2) •FAD (FMN) « FADH.« FADH2 (FMNH2) •Q6 •Q10 •plastochinon •Fe2+ → Fe3+ •Fe2+ → Fe3+ •-CH2OH •-CHO •Izoenzymy •Katalytická triáda „Lock and key“ model figure 5-09 •? figure 5-10 „Induced fit“ model „Transition state“ model figure 5-11 Aktivní místo •Efekt přiblížení – překryv orbitalů •Specifické mikroprostředí – pH, I, hydrofobita atd •Dehydratace •Koncentrační efekt - 105 •Vhodná orientace • • Proximitní a orientační http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter16/Images/8883n16_15.jpg •INTERMOLEKULÁRNÍ REAKCE •INTRAMOLEKULÁRNÍ REAKCE Aktivační energie • • • •Uvolněna při vazbě substrátu na enzym Mechanismus katalýzy •Acidobazická – Asp, Glu, His, Lys, Arg, • Cys, Ser, Tyr • •Kovalentní – Ser, kofaktory • •Kovovými ionty Acidobazická kyselé proteázy figure 5-12 Kovalentní serinové proteázy unnumbered figure pg 150 Kovovými ionty figure 5-13a Kovovými ionty figure 5-13b figure 5-13c F15-09.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: Lysozym •+ F15-08.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: •1922 •EC 3.2.1.17 peptidoglykan N-acetylmuramoylhydrolase •Mukopeptid N-acetylmuramoylhydrolase, Muramidase Lysozym • F15-10a.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: F15-12.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: Lysozym lysozyme •pH 5,5 •Glutamát dehydrogenasa •Oxidasa aminokyselin •ureasa •ADH •oxidasa L-aminokyselin F13-01.jpg 000627D2Macintosh HD B74677AA: F13-03.jpg 000627D2Macintosh HD B74677AA: Enzymová kinetika •Studium vlivu různých chemických a fyzikálních faktorů na enzymové reakce •[E], [S], [I], pH, I, T • • •Mechanismus reakce •Stavba aktivního místa •Regulaci • •Regulovatelnost Enzymové reakce •Jednosubstrátové A → P • • • •Dvousubstrátové A + B → P + S • • • •Vícesubstrátové A + B + ….→ P + S + … • • + H2O figure 5-05 http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chapt08/212-2.jpg > Počáteční rychlost enz.reakce C:\Sharka\TEXTYUCE\OFCH\prednasky\obr pro prednasky\010-011-kinetika\022-poc rychlost.jpg •počáteční rychlost – tg úhlu •A340 figure 5-04 •substrátu •substrátu > Ustálený stav E + S ES ↔ EP E + P F14-07.jpg 000627DBMacintosh HD B74677AA: •ms Odvození rovnice Michaelis Mentenové • k1 k2 •E + S <===> ES ===> P + E k-1 •k1 [E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] • [E]tot = [E] + [ES] • [E] = [E]tot - [ES] •k1 ([E]tot - [ES])[S] = k-1 [ES] + k2 [ES] •([E]tot - [ES])[S] = (k-1 + k2/ k1) [ES] • Km= (k-1 + k2/ k1) •([E]tot - [ES])[S] = Km [ES] •[E]tot [S] - [ES][S] = Km [ES] •1.Předpoklad – koncentrace [ES] se v ustáleném, stavu nemění •[E]tot [S] = Km [ES] + [ES][S] •[E]tot [S] = [ES] (Km + [S]) •[ES] = [E]tot [S] /(Km + [S]) •v1 = v-1 + v2 Odvození rovnice Michaelis Mentenové • k1 k2 •E + S <===> ES ===> P + E k-1 • [ES] = v0/k2 • Vmax= k2 [E]tot •2.Předpoklad – tvorba produktu je přímo úměrná koncentraci [ES] •[ES] = [E]tot [S] /(Km + [S]) •v0/k2 = [E]tot [S] /(Km + [S]) •v0= k2 [E]tot [S] /(Km + [S]) •v0= Vmax [S] /(Km + [S]) • •vo = •Vmax [S] •Km + [S] • •[S] = nízká → vysoká •Reakce 0 řádu •Reakce1 řádu Stanovení Km a Vmax figure 5-03 unnumbered figure pg 142 table 5-3 table 5-4 Km ?? •Taková koncentrace substrátu, že reakce poběží polovinou Vmax –[mol/dm3] • •Je mírou afinity substrátu k enzymu • •Nezávisí na koncentraci enzymu, závisí na prostředí T, I, pH, efektory atd. • Proč Km ?? •Přibližná hodnota intracelulární koncentrace substrátu •Substrát s nižší hodnotou Km je pravděpodobně fyziologický •Hodnotu lze ovlivňovat – možnost regulace •Srovnání enzymů •Stanovení enzymové aktivity •fosforylasa •kreatinkinasa •(akceptory elektronů, koenzymy) •Laktátdehydrogenasa •A – NADH, B – Pyr) •Transaminázy •A-AMK, B-OxoK •Alkoholdehydrogenáza •A – NAD+, B – EtOH) •Transaminasy •A-AMK, B-OxoK http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter14/Images/8883n14_20.jpg http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter14/Images/8883n14_19.jpg •Sekvenční •Ping-pongový •pH stabilita!!! •Denaturace •Disociace nabitých •skupin enzymu •Disociace nabitých •skupin substrátu figure 5-06 •Denaturace •Disociace nabitých •skupin enzymu •Disociace nabitých •skupin substrátu •Disociace nabitých •skupin složek pufru - pH figure 5-07 Inaktivace Ser diisopropylfosfofluoridem (DIPF) figure 5-15b Inhibice SDH malonátem Malonic Inhibition figure 5-15c •čistá •směsná figure 5-15d •Akompetetivní inhibice •Akompetetivní inhibice • table 5-5 •*Inhibitor se váže mimo vazebné místo (Kii = Kis ≡ Ki) •**Inhibitor se váže částečně na i mimo vazebné místo (Kii≠Kis) •* •** figure 5-18 •Regulace kinetikou Regulace kinetikou enzymu •ostatní •hexokinasa •Km = 0,1 mM •játra •glukokinasa •Km = 10 mM •↓ pH Fosfofruktokinasa regulace snížením pH •↓ •ATP + •↓ pH •Eukaryota Regulace koncentrací enzymu Prokaryota > Operonový model Allosterie allosteric2 Allosterie allosteric Allosterie allosteric Allosterický aktivátor an-allo-activator Allosterický inhibitor an-allo-inhibitor Symetrický model figure 6-05 Sekvenční model figure 6-06 Allosterie hemoglobinu Myoglobin Hem Vazba O2 na Hb Vazba O2 na Hb Hb versus Mb Solné můstky Solné můstky Solné můstky Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 pro05-04 Vliv BPG Vliv BPG a nadmořská výška Vliv BPG a nadmořská výška Fetální versus normální Hb Fetální versus normální Hb Regulace kovalentní modifikací glykogenfosforylasa • • • • • • •P •P •P •P •Amplifikace signálu •hormon •enzyma…………………………………………enzymn •………………………….. •enzyma………………………………………………..enzymn •………………………….. Regulace kovalentní modifikací glykogenfosforylasa figure 6-07 Regulace kovalentní modifikací figure 6-08 Regulace kovalentní modifikací Regulace zpětnou vazbou Regulace •Umělé enzymy • •Úprava přírodních enzymů http://www.hplc.cz/Chiral/Chrom/Cyclodextrins.png •Klotz, Scarpa - 1971 Abzymy figure 6-11 •Schultz, Lerner - 1986 Ab + Ag → AbAg E + S → ES •→ E +P Ribozymy – katalytická RNA 1989 Nobelova cena • •Altman (Yale University) ribonukleasa P • •Cech (University of Colorado) mRNA http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b3/Thomas_r._cech.jpg http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1989/altman_postcard.jpg Ribonukleasa P (Altman) všechny organismy figure 6-12 •zrání tRNA Autokatalytická mRNA (Cech) Tetrahymena thermophila figure 6-13 •splicing DNAzymy (1994) •Ronald R. Breaker (Yale University) • •Štěpení RNA v přítomnosti Pb2+ DNAzymy • •Katalyzují např. : –DNA fosforylaci –DNA adenylaci –DNA deglykosylaci –DNA štěpení – 10-23 DNAzym 10-23 DNAzym 10-23 DNAzym Aptamery •Synteticky vytvořené : • •RNA oligonukleotidy • •ssDNA oligonukleotidy • •peptidy • Aptamery •Synteticky vytvořené molekuly schopné se vázat na cílové molekuly : • •s vysokou afinitou • •s vysokou specifitou Struktura aptameru proti hemaglutininu viru chřipky typu H5N1 Aptamery versus protilátky •Vysoká stabilita • •Jednoduchá výroba • •Nízká imunogentita • •Různé cílové molekuly • SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment Využití enzymů •Celé buňky • •Extrakty z buněk • •Enzymy volné versus imobilizované Využití enzymů – celé buňky •Nejstarší metody •Potravinářství –Výroba sýrů a jogurtů (Lactobacillus) –Výroba piva a vína (Saccharomyces cerevisiae) –Výroba octa (Saccharomyces cerevisiae) •Chemické výroby –Výroba kyseliny citronové (Aspergillus niger) –Výroba antibiotik (plísně) –Výroba vitaminů, steroidů a aminokyselin •Těžké technologie –Čištění odpadních vod –Zpracování rud • Rhodanasa (EC 2.8.1.1) • •CN- + S2O32- ® SCN- + SO32- • •Homo sapiens • Detoxikace kyanidu - otravy • - cigaretový kouř • - glykosinoláty Brassicacceae • •Acidithiobacillus ferrooxidans • Biohydrometalurgie • • Životní prostředí • • thiobacil Využití enzymů – isolované enzymy •Široká paleta enzymových preparátů • •Invertasa – výroba invertovaného cukru •Proteasy, lipasy – prací prostředky •DNA-polymerasy, restrikční endonukleasy, ligasy – genové technologie • b-galaktosidasa – odstraňování laktosy z mléka • •Další možná využití: –chemické synthesy Organické syntézy •+ - specifita (stereospecifita) • - neextrémní podmínky (ekonomika, ŽP) • •- - malá stabilita • - nevodná prostředí • - omezená dostupnost (cena) • - regenerace Volné versus imobilizované enzymy •Stabilita enzymů vzrůstá v imobilizovaném stavu •Imobilizované enzymy mohou být používány opakovaně ® •pokles nákladů •Produkt reakce není kontaminován enzymem ® •odpadá potřeba purifikace •Imobilizované enzymy mohou být použity v kontinuálních procesech • • • • • Výhody imobilizovaných enzymů Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Proteolytické enzymy •Biodetergenty (termostabilní, alkalické bakteriální proteasy) •Mlékárenský průmysl (chymosin z telecích žaludků à specifická proteolýza kapa-kaseinu à tvorba sýřeniny) •Krmivářský průmysl à výroba technických hydrolyzátů bílkovin •Masný průmysl à tenderizace (změkčení) masa (rostlinná proteasa papain) •Pivovarnictví à enzymové stabilizátory piva (odstraňování chladových zákalů) • • Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Amylasy •α-amylasy à hydrolýza 1,4-α-glukosidických vazeb uvnitř polysacharidové molekuly • •Ztekucování škrobu (nezbytné při následné výrobě glukosových syrupů a glukosy) •Součást biodetergentů (odstraňování škrobového pojidla z textilních vláken) Nejvýznamnější technické aplikace enzymů (glykosidasy) •β-amylasy à odštěpují maltosové jednotky z neredukujícího konce polysacharidového řetězce • •Glukoamylasa à odštěpuje glukosové jednotky od neredukujícího konce (zpracování škrobu na škrobové sirupy; odbourávání zbytkových dextrinů v pivu à vyšší stupeň prokvašení, diabetické pivo) •Invertasa à hydrolýza sacharosy na glukosu a fruktosu, výroba invertního cukru •β-galaktosidasa à hydrolýza laktosy na glukosu a galaktosu (výroba delaktosovaného mléka, mléko pro výrobu zmrzliny (zabránění krystalizace laktosy) • Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •glukosaisomerasa (xylosaisomerasa) • •Isomerace glukosy na fruktosu •Výroba fruktosových sirupů (42 % - 55 % fruktosy) z glukosových sirupů (zejména z kukuřičných a obilních škrobů) à vyšší sladivost Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Celulasy •Komplexní enzymový systém katalyzující hydrolýzu celulosy • •Celulasa z Trichoderma viridae à odbourání nativní celulosy •Zpracování celulosové suroviny (dřevěné odpady, odpadní papír) •Výroba instantních potravin (káva, čaj), digestiva v krmných směsích, zvýšení účinnosti extrakce šťav z rostlinných materiálů Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Lipasy • •Biodetergenty •Ovlivnění chuti a vůně potravinářských výrobků (sýrařství !!!) •Součást digestivních přípravků Příklady lékařských aplikací enzymů • •Fibrinolýza (cílené rozpouštění krevních sraženin) à plasmin, streptokinasa, urokinasa (aktivátory plasminogenu) •Cílená tvorba krevních sraženin à thrombin •Trávicí enzymy •Trypsin à čištění ran od hnisu •Lysozym à oční kapky • Enzymy jako analytická čidla •Specifita – reagují pouze s daným substrátem • •Citlivost • •Analýza nepřečištěným vzorků – tělní tekutiny Analytická biochemie •Stanovení substrátů • •Stanovení inhibitorů • •Stanovení aktivity enzymů End-point versus kinetické stanovení •0 • •čas •A •inkubace •[S] •n[S] •A ® P > Reakce v roztoku •kreatinkinasa •Přímé stanovení • • •Pomocná reakce •Kreatin-P + ADP Kreatin + ATP • > Izoenzymy LHD • • Automatické analyzátory • •Zvyšující se množství glukosy •žádná •glukosa Diagnostické proužky • Biosenzory Amperometrické biosenzory •Leland C. Clark Jr. •1956 File:Dr. Leland C. Clark Jr 2005.jpg LED •Glukosa oxidasa •oxiduje glukosu •za uvolnění •elektronů – které •jsou detekovány převodníkem •A převedeny na elektrický proud •Transducer •Amplifier •Generovaný proud je •proporcionální •množství glukosy •znázorněnému na display •Glukosa •V krvi •Glukosa •oxidasa Biosensor na glukosu Konduktometrické biosenzory Potenciometrické biosenzory ELISA http://exploreable.files.wordpress.com/2011/05/ch4f35.jpg ELISA – stanovení antigenu ELISA – stanovení protilátky negativní pozitivní ELISA - vybavení Absorbance Microplate Reader: ELx800 sc-204464 http://www.labmark.cz/image.php?file=xplorer_8ch.jpg&size=m sc-204464 http://virology-online.com/general/ELISA.jpg Piezoelektrický biosenzor http://www.peta.unas.cz/biosenzory/Biosenzory_soubory/obrazky/piezo.gif http://www.tms.org/pubs/journals/JOM/0010/Kumar/fig4.gif http://www.tms.org/pubs/journals/JOM/0010/Kumar/fig5.gif Kantilever biosensor.gif http://www.intechopen.com/source/html/43444/media/image6.png •0,5 mm