PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 1 PŘÍRODNÍ POLYMERY Laboratorní metody stanovení přírodních polymerů RNDr. Ladislav Pospíšil, CSc. POLYMER INSTITUTE BRNO spol. s r.o. 14. 12. 2016 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 2 Pokud získáme grant, některé metody budou v těch laboratorních cvičeních LITERATURA – pouze ta, obsahující alespoň něco o stanovení přírodních polymerů •J. Kodet, S. Štěrba, L. Šlechta: Modifikované škroby, SNTL Praha, 1982 •P. Mokrejš: Aplikace přírodních polymerů – Návody k laboratorním cvičením z předmětu, skripta UTB Zlín, 2008 •Z. Holzbecher, J. Churáček a kol.: Analytická chemie (kap. 13.6), SNTL/ALFA, Praha 1987 • 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 3 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 4 img270.jpg Obsahuje hodně metod na bílkoviny & aminokyseliny a na dřevo, málo na škrob 1.Stanovení dusíku 2.Škrob 3.Celulóza 4.Perspektivy stanovení přírodních polymerů • 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 5 Základní problémy stanovení přírodních polymerů 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 6 •Nejsou to chemická individua •Reakce nejsou vždy kvantitativní a používají se přepočítávací koeficienty •Některé reakce nejsou úplně selektivní •Neexistuje souhrnná učebnice či příručka, nutno hledat v různých zdrojích (u analytických reakcí byly alespoň jedna příručka a jedna učebnice v češtině) •Zahraniční literatura obtížně dostupná, pokud vůbec existuje •……………….. •Metoda podle KJEDAHLA •Metoda podle JODLBAUERA (organický dusík vedle anorganického, např. vedle NO3- či NH4+ ) •Metoda podle DUMASE • ………………………… 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 7 Stanovení ORGANICKY VÁZANÉHO dusíku 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 8 Stanovení ORGANICKY VÁZANÉHO dusíku podle KJELDAHLA •Mineralizace na amoniak (NH3, přesněji NH4+) - H2SO4 konc. + K2SO4 (na zvýšení b.v.) + katalyzátor (CuO, CuSO4 bezv., Hg, sloučeniny Se) cca. 400 °C •Vydestilování NH3 vařením s NaOH do H2SO4 •Titrace přebytku H2SO4 na methylčerveň • 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 9 Stanovení ORGANICKY VÁZANÉHO dusíku podle KJELDAHLA - mineralizace 517px-Kjeldahl_digestion_svg.png 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 10 Stanovení ORGANICKY VÁZANÉHO dusíku podle KJELDAHLA – vydestilování amoniaku 749px-Kjeldahl's_distillation_svg.png •Bílkoviny různého původu mají různé složení aminokyselin > nutnost použít Převodní faktory •Mléko: TKN x 6,38 •Maso: TKN x 6,25 •Vejce: TKN x 5,83 •…………………… 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 11 Převodní faktory na obsah bílkovin podle celkového dusíku podle KJELDAHLA (Total KJELDAHL Nitrogen = TKN) •Stanovuje se jako organický dusík •Přidáme trochu MELAMINU a je hotovo! • • • 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 12 Jak v Číně falšovali obsah bílkovin v mléce 280px-Melamine_svg.png 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 13 Škrob •Řada metod na hodnocení vstupních surovin (brambory, obilí) •Metody hodnocení použitelnosti výrobku k danému účelu a ne chemického složení výrobku •Chemické metody jsou založeny na hydrolýze a následujících reakcích oxidačně-redukčních •……………….. • • 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 14 Činidla k reakcím oxidačně-redukčním •Fehlingovo činidlo –I (A): 69,28 g CuSO4 .5 H2O, doplnit do 1000 ml H2O –II ( B): 346 g vínanu sodno-draselného + 120 g NaOH, doplnit do 1000 ml H2O • Fehlingovo činidlo WIKI ENG 06122016.png 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 15 Fehlingovo činidlo se uplatňuje v oxidačně-redukční reakci. Součást činidla se redukuje (měď), substrát se oxiduje Fehlingovo činidlo se připravuje ve dvou částech. V jedné je roztok modré skalice, v druhé hydroxid sodný se Seignettovou solí (vínan draselno-sodný). Ta má za úkol zabránit po smíchání vzniku sraženiny hydroxidu měďnatého. Takto vznikne vínan měďnatý. Úplný zápis 2C2H2(OH)2(COO)2KNa + 2CuSO4.5H2O -----} 2C2H2(OH)2(COO)2Cu + Na2SO4 + K2SO4 + 10H2O Fehlingovo činidlo se přidá např. k formaldehydu (ale lze např. ke glukóze, ta obsahuje též aldehydickou skupinu). Zahřívá se. Kapalina se barví nejprve zeleně, nakonec se vylučuje červený oxid měďný. Měď se redukuje [z +2 na +1, uhlík ve formaldehydu se formálně oxiduje (přijímá jeden kyslík, tedy o 2)] Iontový zápis CH2O+2Cu+2+ 4OH-1 -----} HCOOH + Cu2O+2H2O Úplný zápis CH2O+2C2H2(OH)2(COO)2Cu+4NaOH -----} HCOOH+Cu2O+ 2C2H2(OH)2(COO)2Na2+2H2O 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 16 Při špatném dávkování (přebytek hydroxidu) se též může ve formě zrcadla vyloučit elementární měď. Iontový zápis CH2O+Cu+2+ 2OH-1 -----} HCOOH + Cu + H2O Úplný zápis CH2O+C2H2(OH)2(COO)2Cu+2NaOH -----} HCOOH+Cu+C2H2(OH)2(COO)2Na2+H2O 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 17 Činidla k reakcím oxidačně-redukčním •Nesslerovo činidlo pro detekci NH3 • • • • •Tollensovo činidlo [Ag(NH3)2]NO3 (aq) • –Bradyho činidlo K2HgI4 NESSLEROVO ČINIDLO.png BRADYHO ČINIDLO 213px-2,4-Dinitrophenylhydrazin_svg WIKI ENG.png 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 18 Reakce Fehlingova činidla Fehling_TEST OF ALDEHYDES (right) versus KETONES (left).jpg Keton Neredukuje komplex mědi Aldehyd Redukuje komplex mědi na Cu2O 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 19 Reakce Tollensova činidla Keton Neredukuje komplex Ag Aldehyd redukuje komplex Ag na kovové Ag Tollens.jpg •Polarimetrické stanovení škrobu podle Ewerse •Stanovení aldehydických skupin ve škrobu •Stanovení substituce karboxymethyl derivátů ve škrobu •Stanovení glukózového (dextrózového) ekvivalentu škrobu •Stanovení veškerého cukru jako glukózy ve škrobu •………………….. • • • • • 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 20 Analytika škrobu 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 21 Kohlrauschova baňka Kohlrauschova baňka rod_835_m.jpg V ní se dělá hydrolýza škrobu Má široké hrdlo na nalévání viskózních kapalin 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 22 Analytika škrobu - Polarimetrické stanovení škrobu podle Ewerse 1.Hydrolýza varem s HCl (5 g škrobu + 2x 25 ml 1,124 % HCl) po dobu 15 minut, přidat 15 ml vody 2.Vyčiření kyselinou fosfowolframovou - H3[P(W3O10)4] x H2O (4 %, 10 ml) 3.Filtrace atd. 4.Polarimetrické měření > úhel otočení a 5.Výpočet obsahu škrobu X (% % hmot.) •(může se vzorec lišit pro různé přístroje) • X = (10000 x a)/(l x m x b) b – specifická otáčivost l – délka trubice polarimetru (dm) m – navážka škrobu na stanovení 1. 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 23 img822.jpg Analytika škrobu – Stanovení aldehydických skupin 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 24 Analytika škrobu – Stanovení glukózového ekvivalentu img823.jpg img824.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 25 Analytika škrobu – Stanovení glukózového ekvivalentu img825.jpg Škrob > 0 GLUKÓZA = 100 MALTODEXTRINY cca. 3 AŽ 20 GLUKÓZOVÝ SIRUP min. 20 Analytika škrobu Stanovení celkových cukrů jako glukózy 1.Hydrolýza na glukózu 2.Redukce Fehlingova roztoku > Cu2O 3.Přežíhání > CuO 4.Přepočet na Cu 5.Vyhledání obsahu glukózy podle tabulky Allihnovy •Postup obsahuje i časy pro jednotlivé operace 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 26 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 27 img831.jpg Analytika škrobu Stanovení celkových cukrů jako glukózy 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 28 img826.jpg img827.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 29 img828.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 30 Celulóza img829.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 31 Celulóza 1.Lehce hydrolyzovatelné polysacharidy (hemicelulózy) 2.TĚŽCE hydrolyzovatelné polysacharidy (celulóza a část hemicelulóz) 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 32 img830.jpg Lehká hydrolyzovatelnost je dána PODMÍNKAMI HYDROLÝZY: • Koncentrace kyseliny (2 % HCl) • Doba hydrolýzy (90 minut) 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 33 img832.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 34 img833.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 35 img834.jpg TAPPI = světoznámý finský ústav na výzkum celulózy 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 36 img835.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 37 img836.jpg 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 38 img837.jpg •OBECNĚ •Nástup automatických analyzátorů („vložím vzorek a čekám na čísla na počítači“) bude dále pokračovat •Vzestup fotometrických metod, např. na stanovení bílkovin •Použití enzymatických reakcí •Hnací silou je KLINICKÁ BIOCHEMIE –Minimální či žádné instrumentální vybavení, –Minimální požadavky na SPECIÁLNÍ kvalifikaci (sestra u praktického lékaře) –Minimální či žádné požadavky na přípravu vzorku –Jednoduché vyhodnocení, např. podle barevné stupnice 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 39 Perspektivy stanovení přírodních polymerů 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 40 •Kyselá hydrolýza > barevná reakce s ninhydrinem Fotometrické metody stanovení bílkovin Ninhydrin_staining_thumbprint.png 710px-Ninhydrin-2D-skeletal.png 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 41 •Kyselá hydrolýza > barevná reakce s ninhydrinem Fotometrické metody stanovení bílkovin 800px-Ninhydrin_Reaction_Mechanism_svg.png 14. 12. 2016 PŘÍRODNÍ POLYMERY PŘF MU 10 2016 42 •Kyselá hydrolýza > barevná reakce s amidočerní B10 • Fotometrické metody stanovení bílkovin 620px-Amido_Black_10_svg.png