Dvourozměrná elektroforéza: analýza hladin denitrifikačních proteinů u bakterie Paracoccus denitrificans Pavel Bouchal Laboratoř proteomiky Ústav biochemie PřF MU 2-D proteinová mapa , p122t7 ' p50z1- »■ * P1232* pi2*zT J pw7sa P06753 *» ^ POt7í)2* P10768 P1pf569 r M PI3Í9S 26 po a 'r potyg^pwBs pim «,lpfl7<)54 POUibf: '00505 P12532 P04Ů75 rj[l4 4LlS O033& P2179G Pí 3693 / P306Z6 y ■-■ji 14 PtS<(Q4 P2S1Ě1 yp15531 "Pd&HI h q1g7&1 101 5540 ^PogaBZ^^ Jtj94 30 4.5 5.0 6.0 Langen H. etal.: 2-DE map of human brain proteins. Electrophoresis 20, 907 (1999) Příprava vzorku pro 2-DE Desintegrace biologických vzorků buněk, tkáně Sonikace, French-press, osmotická či enzymatická lýze!!!!! Inhibice proteas (PMSF, Pefabloc™, Complete™)!! (rostliny!!!!) Inhibice fosfatas (Na2V03, NaF)! Odstranění nukleových kyselin (DNAsa I, benzonasa)!!! Odstranění dalších interferujících látek (polysacharidy, fenolické I.)! Nízká iontová síla (10 mM soli)!!!! Homogenisieren Zellaufschluss Suspendieren Verfahrensbeschleunigung Sonochemie Precipitace vzorku (zakoncentrování, delipidace): aceton, trichloroctová kyselina Solubilizace vzorku, pak centrifugace (-16000 g, 20 min, 4°C) Solubilizace vzorku • CHAOTROPNI ČINIDLA omezují vodíkové vazby a elektrostatické interakce 7 M močovina, 2 M thiomočovina • DETERGENTY obalují hydrofobní části bílkovin a tím zvyšují jejich rozpustnost 2-4% CHAPS nebo 1% AS B 14 nebo 1% C7BzO; 0,5-1% TRITON X-100 • REDUKČNÍ ČINIDLA štěpí disulfidické vazby -S-S- mezi cysteiny 50-100 m M dithiothreitol • AMFOLYTY pufrují pH a také zlepšují rozpustnost proteinů Pharmalyte, Bio-Lyte, Ampholyte (2%) Protokol pro přípravu vzorku -sklizení buněk 5000 g, 30 min, 4 C -promytí 50 mM Tris/HCI pH 7.3, supernatant odlít -k peletu přidat lyzační pufr (7M močovina, 4% thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, 2% Pharmalyte 3/10, proteasové a fosfatasové inhibitory) -desintegrace ultrazvukem 60 x 0.1 s -solubilizace 1 h/lab T -centrifugace 16000 g/20 min/4 °C -stanovení bílkoviny -150 jig proteinu precipitovat 7,5 (obj.) násobkem acetonu 1,5 h / -20°C -centrifugace 16000 g/20 min/4 °C -resolubilizace peletu v rehydratačním pufru (7M močovina, 2M thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, 2% Pharmalyte 3/10) -nanesení na IPG strip Bouchal P. Zdráhal Z., Helánová Š., Janiczek O., Hallberg K.B., Mandl M., Proteomics 2006, 6, 4278-4285 1. rozměr: isoelektrická fokusace (IEF) Separace podle pl. Počítají se volthodiny (Vh) • IPG-IEF (proužky s imobilizovaným pH gradientem) -dobrá re p rod u kováte I n ost, napětí až 10000 V, současný standard, komerčně dostupné pH gradient 3-10 NL (gradienty existují v úzkém rozsahu i jedné jednotky pH) Dávkování vzorku: in-gel rehydratace Aparatury na IEF 2. rozměr: SDS-PAGE • Ekvilibrace IPG proužků před SDS-PAGE: obalení proteinů SDS -(uděluje proteinům uniformní náboj na jednotku hmotnosti), krok 1: redukce (DTT) krok 2: alkylace (jodacetamid) • SDS-PAGE (malý formát) 12% (homogenní) Mr 15000-100000 • Pufrový systém: tris-glycin-SDS (=„Laemmli") Aparatury na SDS-PAGE Barvení gelů relat. citlivost • Stříbrem: analytické (problémy s MS!) + + + • Coomassie brilliant blue (mikropreparativní) + koloidníCBB + + • SYPRO Ruby/Orange -fluorescenční + + (+) (analyt.+mikroprep.) • detekce na filmu - autoradiografie + + + (analyt., inkorporace značeného izotopu během biosyntézy proteinů) • DIGE (diferenční gelová elektroforéza) + + (+) (fluorescenční obarvení 2 vzorků před 2-DE analýzou, všechny vzorky v 1 gelu, vizualizace: 3 různé X (jedna referenční)) Obrazová analýza 2-DE gelů • Odečtení pozadí a detekce spotů • Manuální kontrola a korekce detekovaných spotů • Vzájemné přiřazování odpovídajících si spotů na různých gelech v jedné sadě (matchsetu) - MATCHING • Kvantitativní a statistická analýza dat • Tvorba obrazových 2-D databází PDQUEST (Bio-Rad) IMAGE MASTER (Amersham Biosciences) MELANIE (Geneva Bioinformatics) PHORETIX 2-D / AIDA (Nonlinear Dynamics) Možnosti identifikace proteinů • Peptide mass fingerprinting (MALDI-TOF MS) • Částečná sekvenace peptidů (MALDI-TOF MS/MS, LC-MS/MS) L> srovnání s databází (NCBI, Swiss-Prot/TrEMBL) • Western-blotting + imunochemická detekce (protilátky) Webová 2-DE databáze Paracoccus denitrificans http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/menu_frame.cgi?gel=20