•Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií • •C7250 •Část V •Zbyněk Zdráhal • •Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU •Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU •Funkční genomika a proteomika, NCBR PřF •zdrahal@sci.muni.cz •Oddělení funkční genomiky a proteomiky •Národní centrum pro výzkum biomolekul •Přírodovědecká fakulta MU mu1 nfsnf •Proteomické aplikace MS File:Metabolomics schema.png •http://en.wikipedia.org/wiki/File:Metabolomics_schema.png •C7250 •DNA •protein •funkční •protein •mRNA •Posttranslační úpravy •posttranslační modifikace • (fosforylace, glykosylace aj.) •Proteinové komplexy •transkripce •posttranskripční úpravy •(alternativní sestřih aj.) •translace •Proteomika – disciplína zabývající se analýzou proteomu •co se může stát •co se opravdu děje •C7250 •Proteomika - Proč? * z každého genu může vzniknout několik proteinů, resp. jejich • forem, které nelze indikovat na základě analýzy DNA resp. mRNA • * neexistuje přímá korelace mezi obsahem mRNA a výsledným obsahem • proteinů * * funkční význam proteinu závisí velmi často na jeho interakci s jinými • proteiny či DNA/RNA * * na úrovni proteinů lze zachytit epigenetické faktory regulace exprese genu * •C7250 self-portrait-or-desperate-man-gustave-courbet •The Desperate Man, Gustave Courbet, 1844-45 •Analýza proteomu •protein-X •protein •protein •W-protein-Z •X DNA-structure-and-bases • • •charakterizace všech proteinů včetně všech jejich forem v buňce (tkáni, organizmu) v daném čase za daných podmínek Genom •C7250 • •Genom versus Proteom • •relativně stabilní soubor proteinů v buňce v sekvence DNA daném stavu a čase, včetně jejich posttranslačních modifikací •4 základní stavební jednotky 20 zákl. stavebních jednotek • •potřebné analytické techniky nutnost vývoje dostatečně zavedeny (PCR) citlivých a spolehlivých technik k identifikaci a kvantifikaci •Počet organizmů 31.12. 02 2.6. 04 9.10. 06 17.10. 08 7.12. 12 7.12. 15 •Genom hotov 116 192 431 862 3995 7747 •Genom započat 586 906 1748 2371 15018 33572 • 702 822 2179 3233 19013 41319 • zdroj: http://www.genomesonline.org/ • •NCBInr 20081017 7 124 886 sequences ( 2 457 960 432 residues) •NCBInr 20151125 77 306 371 sequences (28 104 191 422 residues) •NCBInr 20171125 135 744 157 sequences (49 805 139 192 residues) • • •C7250 •Arabidopsis thaliana • Huseníček rolní arabi_bw1tr •Genom 0.135 x 109 bp, ~ 27 000 genů •32 000 proteinů •C7250 •http://www.uniprot.org/taxonomy/complete-proteomes •člověk - genom 3.3 x 109 bp, ~ 21 000 genů •http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/GenomeSizes.html 54_evoluce •Identifikace mikroorganizmů pomocí MALDI-MS •kultivace • extrakce •peptidů/proteinů •MALDI MS •(3 – 20 kDa) • • • • • • • • • • •PCA analýza •databáze MALDI MS profilů BD18215_ •identifikace mikroorganizmu • •taxonomie •Analýza MS profilů •C7250 • • •5000 •7000 •9000 •11000 •m/z •0 •500 •1000 •1500 •2000 •2500 •a.i. • • • • • • •5000 •7000 •9000 •11000 •m/z •0 •500 •1000 •1500 •2000 •2500 •a.i. • • • • •Alcaligenes faecalis •Sphingomonas paucimobilis •Aeromonas hydrophila •Pseudomonas aeruginosa •MALDI-MS spektra (profily) vybraných bakterií •C7250 •0 •100 •200 •300 •400 •500 •600 •700 •800 •900 •1000 • Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5683 CCM • Campylobacter fetus subsp fetus CCM 6210 CCM • Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5682 CCM • Campylobacter coli CCM 6211 CCM • Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6189 CCM • Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6191 CCM • Campylobacter jejuni CCM 6214 CCM • Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 7212 CCM • Corynebacterium pilosum CCM 6140 CCM • Corynebacterium urealyticum CCM 3975 CCM • Corynebacterium urealyticum CCM 3976 CCM • Corynebacterium urealyticum CCM 4186 CCM • Finegoldia magna CCM 3785 CCM • Streptococcus mitis CCM 7411 CCM • Serratia rubidaea CCM 3412 CCM • Peptostreptococcus anaerobius CCM 3790 CCM • Staphylococcus epidermidis CCM 2124 CCM • Staphylococcus epidermidis CCM 2446 CCM • Staphylococcus epidermidis CCM 7221 CCM • Staphylococcus saprophyticus CCM 3317 CCM •Distance Level •Grafické vyjádření podobnosti MALDI-MS profilů bakterií • •L. Tvrzová, A. Teshim, I. Sedláček, M. Lexa, A. Voráč, O. Šedo,, A. Kostrzewa, T. Meier • •identifikace na základě srovnání naměřeného profilu s profilem z databáze * uznaná metoda v klinické praxi •C7250 •100 •200 •300 •400 •500 •600 •700 •800 •900 •1000 •Brewery 1 bottle 3 •Brewery 1 bottle 4 •Brewery 1 bottle 5 •Brewery 1 bottle 1 •Brewery 1 bottle 2 •Brewery 2 bottle 3 •Brewery 2 bottle 4 •Brewery 2 bottle 5 •Brewery 2 bottle 1 •Brewery 2 bottle 2 •Brewery 3 bottle 1 •Brewery 3 bottle 2 •Brewery 3 bottle 3 •Brewery 3 bottle 4 •Brewery 3 bottle 5 •Distance Level •MALDI-MS profilování piva •MALDI-TOF MS fingerprint containing proteins •0.5 •1.0 •1.5 •2.0 •2.5 •4 •x10 •2000 •3000 •4000 •5000 •6000 •7000 •8000 •9000 •10000 •spolupráce s FCH VUT Brno •prof. Márová •C7250 •Analýza profilů –včasná detekce chorob •(peptide profiling, pattern profiling) • BD18215_ •MALDI MS, SELDI MS •(3 – 20 kDa) •klastrová analýza • • • • • • • • • • • • • • • • • •žádná či minimální úprava vzorku •(ionex, IMAC, afinitní sorbent) • * velké množství faktorů ovlivňujících proteinové složení • nesouvisejících s diagnostikovanou nemocí • velká variabilita profilů • * nastavení limitů pro pozitivní/negativní detekci choroby • • * kombinace s dalšími diagnostickými metodami •C7250 • •J. LaBaer et al., J. Proteome Res., 4 (4) 1053-1059 (2005). • •M. Ehmann et al., Pancreas, 34 (2) 205-214 (2007). •C7250 • • •Využití MS pro vyhledávání biomarkerů • •Pattern profiling •přímá MS analýza vzorků •(MALDI MS, SELDI MS) •srovnávání peptidového (proteinového) složení vzorku „zdravého“ a nemocného •(bez identifikace, statistická analýza) • •včasná diagnostika chorob •Identifikace biomarkerů • •Separace •GE. LC •srovnávání peptidového (proteinového) složení vzorku „zdravého“ a nemocného • •MS •MS/MS •identifikace rozdílových proteinů • •specifická protilátka •Imunodetekce •SRM, SWATH/Protein arrays • •specifita biomarkeru !!! •C7250 https://s-media-cache-ak0.pinimg.com/736x/79/f8/39/79f8397406fc725e32e659addc624213.jpg Comparison of human cancer cell line proteome and transcriptome •C7250 126 frakcí 72 frakcí •N. Nagaraj et al., Mol. Syst. Biol., 7, 548 (2011). 10 mg proteins Protein fractionation Peptide fractionation pic11840 •Relativní kvantifikace proteomu pomocí MS • • • • • • •100% * Pomocí izotopických značek (srovnání omezeného počtu vzorků) •Kvantifikace proteinu •Cílená kvantifikace vybraných proteinů pomocí MS •C7250 * Pomocí „label-free“ přístupy (srovnání neomezeného počtu vzorků, menší přesnost) •replika 1 • • •replika 2 • • •replika 3 * MRM, SWATH •C7250 • •B •Charakterizace změn proteomu •diferenční proteomika •spolupráce s Ústavem biochemie PřF MU •P. Bouchal et al., Proteomics 2006, 6, 4278–4285. •Acidithiobacilus ferrooxidans grown on ferrous iron (A) and elemental sulfur (B) •analýza obrazu 2-D gelů •LC-MS/MS vybraných spotů s rozdílnou intenzitou • • •oddělená identifikace (MS) od kvantifikace (intenzita spotů na gelu) •směsné spoty • •kontrola •po infekci •vzorky stěny střeva •proteinové izoláty •digesce trypsinem •reduktivní alkylace • •LC-MS/MS •data processing •C7250 •Vyhledávání markerových proteinů u kuřat infikovaných salmonelou •relativní kvantifikace * identifikováno více než 2300 proteinů * kvantifikační údaj pro více než 1900 •spolupráce s VÚVel Brno •Matulova M. et al., Vet. Res., 44:37 (2013) Accession Description 363741657 PREDICTED: syntenin-2-like [Gallus gallus] 41.032 118095649 PREDICTED: beta-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoprotein beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase 3 [Gallus gallus] 34.036 4927286 alpha enolase [Bos taurus] 33.575 112491068 Chain A, Crystal Structure Of A M-Loop Deletion Variant Of Ment In The Cleaved Conformation 30.221 56118294 ribonuclease homolog precursor [Gallus gallus] 25.497 363741459 PREDICTED: protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E [Gallus gallus] 24.786 •infikovaný/ •kontrola •ověřění pomocí real-time PCR • •objasnění molekulárních mechanizmů •nalezení markerových proteinů pro časnou diagnostiku •C7250 •C7250 •Kvantifikace enterotoxinů •cílená analýza vybraného proteinu •MRM * výběr peptidů vhodných pro kvantifikaci * absolutní kvantifikace pomocí AQUA peptidů • • •výsledek - zjištěné množtví/koncentrace daného proteinu ve vzorku •SWATH MS •Q-TOF, MS/MS < 10 ppm •Retention time •m/z * klasické DB prohledávání nelze * srovnání s knihovnami ref. MS/MS spekter * Relativní i absolutní kvantifikace •celé MS/MS spektrum •Gillet et al, MCP, 11, 1-17 (2012) •C7250 •Liu et al, Expert Rev. Mol. Diagn., 13(8), 811 (2013) •Shot gun vs SRM vs SWATH •C7250 •Liu et al, Expert Rev. Mol. Diagn., 13(8), 811 (2013) •C7250 •Liu et al, Expert Rev. Mol. Diagn., 13(8), 811 (2013) •C7250 a62 •Chen et al., J. Chromatogr. B, 879, 25 (2011) Analýza fosfoproteomu – různé typy frakcionace •C7250 ERLIC - Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography Each method – over 4000 phoshopeptides In total – 9069 phosphopeptides – 9463 sites / 3260 proteins •Chen et al., J. Chromatogr. B, 879, 25 (2011) Analýza fosfoproteomu – různé typy frakcionace •C7250 •C7250 •Analýza fosfoproteomu – kvalita a kvantita •Huang et al., J. Proteomics, 106, 125 (2014) Porcine muscle Postmortem changes 160 phosphoproteins with 784 sites identified 184 phosphorylation sites on 93 proteins had their phosphorylation levels significantly changed. •Huang et al., J. Proteomics, 106, 125 (2014) •C7250 •Analýza fosfoproteomu – kvalita Porovnání replikátů The panels show the phenotypic phosphoproteome comparison organized by GO biological process for mitotic (left) and S phase (right) cells. Proteins involved in metabolic processes have high-occupancy phosphorylation sites during mitosis, but low-occupancy sites during S phase (color scale: yellow, high overrepresentation; dark blue, high underrepresentation). Olsen J.V. et al., Sci. Signal., 3 (104) ra3 (2010) * * quantified 6027 proteins * quantified 20,443 unique phosphorylation sites Analýza fosfoproteomu změny během buněčného cyklu CG010 - HELA buňky - SILAC značení - TiO2 frakcionace - LC-MS/MS (Orbitrap) •C7250 * to establish a set of methods •- HDAC Fluorimetric Cellular Activity Assay Kit •- MALDI-MS of N-terminal part of histones (after Glu-C digestion) •- AUT-AU 2-D GE combined with LC-MS/MS analysis •Hodnocení účinku inhibitorů histonových deacetyláz • •Valproic acid •Entinostat •Total HDAC inhibiton effect •Činčárová et al, Mol. Biosyst. (2012) •B-CLL MEC-1 cells •C7250 • •Valproic acid •Entinostat •MALDI-MS of Histone H4 acetylated forms •N-terminal fragment (1-53 AA) • • • • •control •A E 0 4 acetylations •Hodnocení účinku inhibitorů histonových deacetyláz •C7250 • •Valproic acid •Entinostat •Changes of particular H4 acetylated forms vs inhibitor concentration •(24h treatment) • •A E 0 4 acetylations •VPA [mM] •Enti [mM] •Hodnocení účinku inhibitorů histonových deacetyláz •C7250 • •AUT-AU 2-D GE of histone extract • •Hodnocení účinku inhibitorů histonových deacetyláz •C7250 • •AUT-AU 2-D GE of histone extract • •ctrl •ctrl •VPA •ENTI •A E 0 4 acetylations •Hodnocení účinku inhibitorů histonových deacetyláz •C7250 •MALDI-MS •2-D AUT-AU GE • •výška píků •intenzita spotů • •Incubation time (hr) •Změny jednotlivých acetylovaných forem v závislosti na čase inkubace •(2 mM VPA) •Hodnocení účinku inhibitorů histonových deacetyláz a61 * > 80% proteinů je funkčních až po začlenění do komplexu • * ~ 10000 typů interakcí • Aloy P., Russell R. B.: Nat. Biotechnol. 22 (10), 1317-1321 (2004) •Charakterizace proteinových komplexů •funkční proteomika •purifikace •komplexu •vzorek •(buněčná kultura) •MS/MS •analýza • • •potvrzení •interakcí • • • • • * vyhledávání nových interakčních partnerů * možnost studia „celého“ komplexu •C7250 •T. Köcher, G. Superti-Furga: Nat. Methods, 4(10), 807-815 (2007). •Purifikace proteinových komplexů •in vivo exprese proteinu se značkou • •vysoký stupeň čistoty komplexu •ztráta slabě vázaných členů komplexu •C7250 •Gavin A.-C. et al.: Nature, 440 (30), 631-636. • • identifikace jednotlivých členů komplexu včetně posttranslačních modifikací • • validace interakčních partnerů (odlišení nespecifických interakcí) • • určení poměrů jednotlivých členů komplexu (stechiometrie) • • určení prostorové struktury komplexu (cross-linking) •Možnosti MS v analýze komplexů •C7250 • •ctrl •komplex •Identifikace jednotlivých členů komplexu •C7250 •digesce in gel •LC-MSMS • • • •ctrl •komplex •digesce in solution •LC-MSMS •sample prep •možno označit proteiny značkami pro relativní kvantifikaci a a vzorky spojit •Potvrzení interakčních partnerů •W. Yang et al., Proteomics 2008, 8, 832–851 •nespec. interakce 1:1 •C7250 a56 8M slina pH3,9-5,1 13-2-09 •Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů •de novo sekvenování •Obp3A •Obp3B •Obp2 •Myodes glareolus * sliny * 2D gelová elektroforéza * MS/MS vybraných spotů •Stopková R., Zdráhal Z., Ryba Š. et al, BMC Genomics 2010, 11:45 •spolupráce s PřF UK Praha * není znám genom * nejsou protilátky •C7250 •C7250 • •RNA analysis •(FS CU Prague) •proteomic analysis •(FS CU/Proteomics CF) • •RNA isolation •cDNA synthesis •PCR with Aphrodisin primers • (hamster) •purification •cloning •sequencing •initial •aminoacid sequence • •protein isolation •2D GE • •in-gel digestion •MALDI-MS/MS • •de novo •corrected AA sequence •(Blast, new proteins) • •database of OBP protein sequences •identification of protein isoforms • • •Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů • • • • • •m/z 3079.4 •DAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR •MALDI-MS/MS •původní sekvence - QAELEGKWVTTAIAADNIDTIEEEGPMR (OBP3) • • DAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR • • HAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR •Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů •MALDI-MS/MS a LC-MS/MS •manuální interpretace spekter •C7250 a75 •MS Imaging •C7250 •samples: * fresh frozen tissue sections * individual cells or clusters of cells isolated by laser-capture microdissection or contact blotting of a tissue on a membrane target. •MALDI-MS imaging •MS analysis • * systematické scanování plochy vzorku bod po bodu * obraz odpovídá plošné distribuci jednotlivých m/z • distribuci peptidů resp. proteinů * •C7250 • • • • •MALDI-MS imaging •M. Stoeckli, T.B. Farmer, R.M. Caprioli: J Am Soc Mass Spectrom, 10, 67–71 (1999) •C7250 •MALDI-MS imaging •Chaurand et al:Anal. Chem.2004, 76,1145-1155 •C7250 http://dghxm7w6km1w9.cloudfront.net/content/ajpendo/302/8/E1016/F5.large.jpg?width=800&height=600&c arousel=1 Degradation of Ang III and Ang-(1–7) in mouse kidney sections. •C7250 Grobe N. et al, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 302 (8), E1016 (2012) •MALDI-MS imaging •Konec hlášení