1
Spektrofotometrické stanovení standardního
redoxního potenciálu cytochromu c
TEORETICKÁ ČÁST
Redoxní potenciál
V biochemii hrají významnou roli oxidačně-redukční (redoxní) reakce, spojené s přenosem elektronů
mezi redoxními páry. Reakci redoxního páru 1 (Ox1/Red1) s redoxním párem 2 (Ox2/Red2) lze
schematicky psát jako:
Ox1 + Red2 ↔ Red1 + Ox2 (1)
O termodynamicky možném směru toku elektronů rozhodují aktuální hodnoty tzv. redoxních
potenciálů E obou párů. Při průběhu reakce (1) zleva doprava je E1 > E2 a pro opačný směr E1 < E2.
Jinak řečeno, akceptorový pár má vyšší redoxní potenciál než pár donorový; elektron se mezi
redoxními páry přesouvá ve směru vzrůstu redoxní potenciálu. Nachází-li se reakce (1) v rovnováze,
platí E1 = E2.
Redoxní potenciál E je definován jako rozdíl elektrického potenciálu (tj. napětí) mezi inertní sběrnou
elektrodou, která v rovnováze s danými koncentracemi [Ox] a [Red], a standardní vodíkovou
elektrodou, obsahující standardní koncentrace redoxního páru 2H+
/H2 (obr. 1).
Vztah mezi E a poměrem [Ox]/[Red] vyjadřuje Nernstova rovnice
[ ]
[ ]Red
ln0 Ox
nF
RT
EE += (2)
Obsahuje dva základní parametry: E0
, standardní redoxní potenciál, a n, počet elektronů potřebných
k redukci Ox na Red. Změříme-li hodnoty poměru [Ox]/[Red] při různých hodnotách E a sestrojíme-li
graf závislosti E na ln([Ox]/[Red]), dostaneme podle (2) přímku se směrnicí RT/nF (z níž lze určit n) a s
úsekem na svislé ose rovným E0
. Jsou-li v roztoku v rovnováze dva redoxní páry, z rovnosti E1 = E2
plyne
Obr. 1. Měření redoxního potenciálu E
pomocí standardní vodíkové elektrody.
Využívá se voltmetru s vysokým vnitřním
odporem, aby byl zajištěn bezproudový stav.
Roztoky v obou částech jsou vodivě spojeny
solným můstkem. Pro [Ox]=[Red]=1
dostaneme standardní redoxní potenciál E
0
.
V praxi se obtížně realizovatelná vodíková
elektroda nahrazuje jinými referenčními
elektrodami se známým potenciálem.
2
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]2
2
2
0
2
1
1
1
0
1
Red
ln
Red
ln
Ox
Fn
RT
E
Ox
Fn
RT
E +=+
a po úpravě
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
( )0
1
0
2
1
2
2
2
1
1
1
Red
ln
Red
ln EE
RT
FnOx
n
nOx
−+= (3)
Závislost ln([Ox1]/[Red1]) na ln([Ox2]/[Red2]) má tedy podobu přímky se směrnicí n1/n2 a úsekem
(n1F/RT)(E2
0
- E1
0
). Známe-li hodnoty E2
0
a n2, můžeme určit E1
0
a n1.
Spektrofotometrické stanovení poměrů [Ox]/[Red]
U mnohých biochemicky významných redoxaktivních látek lze aktuální poměry [Ox]/[Red] zjišťovat
spektrofotometricky. Základním předpokladem je, že obě redoxní formy rozdílnou měrou absorbují
elektromagnetické záření. Je-li v roztoku pouze jedna absorbující redoxaktivní látka, podle
Lambertova-Beerova zákona při vlnové délce λ pro její absorbanci A(λ) platí
A(λ) = εox(λ)·d·[Ox] + εred(λ)·d·[Red] (4)
kde εox(λ) a εred(λ) jsou molární dekadické absorpční koeficienty oxidované a redukované formy
(závislé na λ) a d délka optické dráhy v roztoku. Celková (analytická) koncentrace c redoxaktivní látky
se při redoxní reakci nemění a je rovna součtu koncentrací obou forem, tedy
c = [Ox] + [Red] (5)
Je-li látka úplně oxidována (tj. [Red]=0) resp. redukována (tj. [Ox]=0), dostáváme absorbance Aox(λ) =
εox(λ)·d·c resp. Ared(λ) = εred(λ)·d·c. Po jejich zavedení namísto absorpčních koeficientů vztah (4)
přechází na tvar (6):
[ ] [ ]
c
A
c
Ox
AA redox
Red
)()()( λλλ += (6)
Podíly [Ox]/c a [Red]/c jsou zřejmě molové zlomky xox a xred oxidované a redukované formy; jejich
součet se podle (5) rovná 1. Při respektování této relace lze z (6) odvodit
[ ]
[ ]
)()(
)()(Red
)()(
)()(
λλ
λλ
λλ
λλ
oxred
ox
red
oxred
red
ox
AA
AA
c
x
AA
AA
c
Ox
x
−
−
==
−
−
==
(7)
a konečně též
[ ]
[ ] )()(
)()(
Red λλ
λλ
ox
red
red
ox
red
ox
AA
AA
x
x
cx
cxOx
−
−
==
⋅
⋅
= (8)
3
Známe-li tedy absorbance plně oxidovaného a plně redukovaného vzorku při vlnové délce λ, můžeme
po změření A(λ) vypočítat dosazením do vztahu (8) aktuální podíl koncentrace oxidované a
redukované formy. Není přitom ani nutná znalost celkové koncentrace c.
Jak se změní situace, jestliže se v roztoku nacházejí dva absorbující redoxní páry, Ox1/Red1 a
Ox2/Red2? Místo vztahu (4) teď máme jeho rozšíření na čtyři komponenty
A(λ) = εox1(λ)·d·[Ox1] + εred1(λ)·d·[Red1] + εox2(λ)·d·[Ox2] + εred2(λ)·d·[Red2]
jedna látková bilance (5) je nahrazena dvěma bilancemi (9)
c1 = [Ox1] + [Red1] c2 = [Ox2] + [Red2] (9)
a (6) dostává následující podobu
[ ] [ ] [ ] [ ]
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
Red
)()(
Red
)()()(
c
A
c
Ox
A
c
A
c
Ox
AA redoxredox λλλλλ +++= (10)
Je důležité si uvědomit, co přesně znamenají absorbance na pravé straně vztahu (10). Například
Aox1(λ) získáme pro zcela oxidovaný vzorek, který obsahuje pouze redoxní pár 1 v koncentraci c1;
redoxní pár 2 není přítomen. Analýza směsi dvou redoxních párů podle (10) tudíž vyžaduje, abychom
měli k dispozici i data pro separátní oxidované a redukované standardy: 1) [Ox1] = c1 a c2 = 0; 2) [Ox2]
= c2 a c1 = 0; 3) [Red1] = c1 a c2 = 0; 4) [Red2] = c2 a c1 = 0.
V případě jednoho redoxního páru v zásadě stačila jedna rovnice (6) spolu s látkovou bilancí (5) k
charakterizaci redoxního stavu systému. Naproti tomu zde jedna rovnice (10) nestačí, protože ze
čtyř obsažených molových zlomků xox1 = [Ox1]/c1, xred1 = [Red1]/c1, xox2 = [Ox2]/c2 a xred2 = [Red2]/c2 jsou
v důsledku (9) nezávislé dva. Východisko spočívá ve využití dat získaných při více vlnových délkách
(λ1 , … , λk). Místo (10) pak máme soustavu k lineárních rovnic o čtyřech neznámých molových
zlomcích redoxních forem














•
•
=














⋅














⋅
••••
••••
)(
)(
)()()()(
)()()()( 1
2
2
1
1
2211
12121111
kred
ox
red
ox
kredkoxkredkox
redoxredox
A
A
x
x
x
x
AAAA
AAAA
λ
λ
λλλλ
λλλλ
(11)
nebo ve zkráceném zápisu
A x = a (11´)
A je matice typu 4 x k, obsahující absorbance standardů, x je čtyřrozměrný vektor molových zlomků a
a je k-rozměrný vektor absorbancí směsi. Pro k > 4 (více rovnic než neznámých) jde o tzv. přeurčenou
soustavu, která obecně nemá řešení. Můžeme však hledat vektor x takový, aby velikost vektoru A x a
nabyla minimální hodnoty. V české verzi Excelu lze k tomuto účelu použít maticové funkce
LINREGRESE(pole_y;[pole_x];[b];[stat])
4
kde pole_y je svislá oblast obsahující složky vektoru a, pole_x je oblast obsahující prvky matice A; pro
argumenty b a stat se volí logická hodnota 0 (NEPRAVDA). Výsledný vektor x se nachází ve vodorovné
oblasti, přičemž jeho složky jsou v buňkách umístěny v opačném pořadí, tedy (xred2, xox2, xred1, xox1). Do
svislé podoby ho lze převést funkcí TRANSPOZICE. Ukázka výpočtu je na obr. 2.
Obr. 2. Ukázka výpočtu molových zlomků redoxních forem z absorbancí standardů a směsi za použití Excelu.
Cytochrom c
Cytochrom c studovaný v naší úloze se běžně izoluje z hovězího srdce. Tento malý (Mr = 12 400) a
dobře rozpustný protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem se 104 aminokyselinovými
zbytky, který nese kovalentně vázaný hem (obr. 3).
Cytochrom c se nachází v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou mitochondrií, kde díky své
schopnosti přecházet mezi oxidovanou a redukovanou formou působí jako přenašeč elektronů
v respiračním řetězci. Pokud se z mitochondrie uvolní do cytoplasmy buňky, může se vázat na zde
přítomný protein Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1). To vede ke vzniku oligomerního
apoptosomu, aktivaci prokaspasy 9 a dalších enzymů účastnících se apoptosy (programované
Obr. 3. Vazba hemu na polypeptidový
řetězec v cytochromu c. Hem je vázán
kovalentně dvěma thioetherovými
můstky, jež vznikly adicí thiolových
skupin dvou zbytků cysteinu na vinyly
v polohách 2 a 4 tetrapyrrolového kruhu.
Kromě toho síra methioninu a dusík
imidazolového kruhu histidinu vystupují
jako další dva ligandy Fe hemu.
5
buněčné smrti). Přítomnost hemové skupiny způsobuje barevnost proteinu. Spektrum roztoku jeho
redukované formy vykazuje ve viditelné oblasti tři hlavní absorpční pásy s maximy při vlnových
délkách 416 nm (γ; tzv. Soretův pás), 520 nm (β) a 550 nm (α). Při oxidaci se spektrum mění zejména
v oblasti vyšších vlnových délek.
Používané metody
Standardní redoxní potenciál cytochromu c budeme stanovovat dvěma metodami. Obě využívají
ekvilibrace redoxního páru cyt cox/cyt cred s druhým (pomocným) redoxním párem a platnosti vztahu
(3).
1) Metoda redoxního pufru
Při tomto měření jako pomocný redoxní pár poslouží směs hexakyanoželezitanu („ferrikyanidu“) a
hexakyanoželeznatanu („ferrokyanidu“). Jejich vzájemná přeměna probíhá jednoelektronově
(Fe(CN)6
3+
e↔
Fe(CN)6
4),
standardní redoxní potenciál je roven 0,43 V. Pokud jsou oba ionty
přítomny ve výrazném stechiometrickém nadbytku vzhledem k cytochromu c, jejich koncentrace se
během reakce s ním prakticky nezmění; podle Nernstovy rovnice (2) se nemění ani redoxní potenciál.
Pár hexakyanoželezitan/hexakyanoželeznatan tedy působí jako redoxní pufr, který udržuje konstantní
redoxní potenciál a „vnutí“ jej páru cyt cox/cyt cred. (Srovnej analogické chování směsi báze s její
protonovanou konjugovanou kyselinou, pufrující pH.) Abychom mohli aplikovat vztah (3), je zapotřebí
pro několik známých výchozích poměrů [hexakyanoželezitan]/[hexakyanoželeznatan] (redoxní pár č.
2) stanovit odpovídající rovnovážné poměry [cyt cox]/[cyt cred] (redoxní pár č. 1). Využijeme k tomu
měření absorbance v oblasti maxima α pásu (550 nm), neboť zde hexakyanoželezitan ani
hexakyanoželeznatan významně neabsorbují. Poměry [cyt cox]/[cyt cred] vypočteme pomocí vztahu
(8).
2) Metoda redoxního indikátoru
Zde bude roztok kromě cytochromu c obsahovat redoxní indikátor 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP)
(obr. 4), jehož standardní redoxní potenciál má podle literatury hodnotu 0,217 V.
Obě látky jsou redukovatelné enzymem xanthinoxidasou během katalytické konverze xanthinu na
kyselinu močovou za anaerobních podmínek. Po nastartování enzymové reakce postupně klesá
redoxní potenciál ve směsi, což se projevuje změnami poměrů koncentrací oxidovaných a
redukovaných forem cytochromu c i DCIP. Analýzou opakovaně zaznamenávaných absorpčních
spekter reakční směsi lze oba tyto poměry určit. Jak bylo zdůvodněno výše, potřebujeme k tomu
spektra oxidovaných a redukovaných standardů, která změříme separátně.
Obr. 4. Struktura 2,6-dichlorfenolindofenolu
6
PRAKTICKÁ ČÁST
1) Metoda redoxního pufru
Přístroje:
Automatické pipety 2-20 μl, 100-1000 μl, 1-5 ml
Spektrofotometr UV-VIS Ultrospec 2000
Voltmetr MT 100
Materiál:
Kádinka 50-100 ml
Referenční kalomelová elektroda
Pt elektroda
Plastové míchadlo
Plastové špičky
Spektrofotometrické plastové kyvety s objemem 3 ml
Chemikálie:
0,1 M K4[Fe(CN)6]
0,1 M K3[Fe(CN)6]
0,1 M Na2S2O4
0.5 mg/ml cytochromu c (cyt c) v 0,1 M sodno-fosfátovém pufru (pH 7,0)
0,1 M sodno-fosfátový pufr (pH 7,0)
Postup:
Připravíme 3 pracovní roztoky smícháním 2,7 ml roztoku cytochromu c s 0,3 ml roztoku 0,1 M
K4[Fe(CN)6], 0,1 M K3[Fe(CN)6] nebo 0,1 M Na2S2O4 ve 3 plastových spektrofotometrických kyvetách.
Pracovní prostor spektrofotometru i roztoky necháme temperovat na teplotu 25 °C.
K roztoku cytochromu c s K4[Fe(CN)6] budeme navíc postupně přidávat 0,1 M K3[Fe(CN)6] jak je
naznačeno ve vzorové tabulce. Měříme absorbance při 550 nm proti 0,1 M fosfátovému pufru, který
bude sloužit jako slepý vzorek. Absorbance budou zaznamenávány do tabulky dle vzoru.
Roztoky A550 log([cyt cox]/[cyt cred]) log([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]])
cyt c + K3[Fe(CN)6]
7
cyt c + Na2S2O4
cyt c + K4[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 15 μl K3[Fe(CN)6]
+ 15 μl K3[Fe(CN)6]
+ 15 μl K3[Fe(CN)6]
Aktuální elektrochemické potenciály lze také měřit přímo s pomocí dvou elektrod. Pracovní platinová
elektroda (kladný pól) a referenční kalomelová elektroda se vloží do roztoku 27 ml cyt c s 3 ml
roztoku 0,1 M K4[Fe(CN)6] a 7,5 μl 0,1 M K3[Fe(CN)6] temperovaného v kádince na 25 °C. Po ustálení
signálu zaznamenáme hodnotu elektrochemického napětí. Následně přidáváme roztok 0,1 M
K3[Fe(CN)6] jak je naznačeno ve vzorové tabulce a zaznamenáváme hodnoty potenciálu.
Roztoky E (V) log([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]])
cyt c + K4[Fe(CN)6] +
7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 7,5 μl K3[Fe(CN)6]
+ 15 μl K3[Fe(CN)6]
+ 15 μl K3[Fe(CN)6]
+ 15 μl K3[Fe(CN)6]
8
Vyhodnocení:
Poměry [cyt cox]/[cyt cred] vypočteme pomocí vztahu (8). Koncentrace, resp. poměry oxidované a
redukované formy hexakyanoželezitanu a hexakyanoželeznatanu, jsou známy a lze je spočítat
z koncentrací zásobních roztoků. Vyneseme graf závislosti log([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]]) na log([cyt
cox]/[cyt cred]), body proložíme lineární regresní přímkou a uvedeme v protokolu vedle grafu i rovnici
této přímky. Úpravou rovnice 3 vypočítáme standardní redoxní potenciál redoxního páru cyt cox/cyt
cred, když je známo, že E7
0
([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]) = +0.43 V a n = 1.
Vyneseme graf závislosti E na log([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]]), body proložíme lineární regresní
přímkou a uvedeme v protokolu vedle grafu i rovnici této přímky. Úpravou rovnice 2 vypočítáme
standardní redoxní potenciál páru hexakyanoželezitan/hexakyanoželeznatan a srovnáme s literární
hodnotou uvedenou výše.
Protokol:
Tabulka s naměřenými absorbancemi a vypočítanými dekadickými logaritmy poměru koncentrací
oxidovaných a redukovaných komponent v reakční směsi.
Graf závislosti log([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]]) na log([cyt cox]/[cyt cred]).
Výpočet standardního redoxního potenciálu cyt c a srovnání s tabelovanými hodnotami.
Tabulka s naměřenými elektrochemickými potenciály páru hexakyanoželezitan/hexakyanoželeznatan
a vypočítané logaritmy poměru koncentrací tohoto redoxního páru.
Graf závislosti E na log([K3[Fe(CN)6]]/[K4[Fe(CN)6]]).
Výpočet standardního redoxního potenciálu hexakyanoželezitanu/hexakyanoželeznatanu a srovnání
s literární hodnotou.
2) Metoda redoxního indikátoru
Přístroje:
Automatické pipety 2-20 μl, 100-1000 μl, 1-5 ml
Hamiltonova jehla 1-5 μl
Spektrofotometr UV-VIS Ultrospec 2000
Materiál:
Parafilm
Plastové špičky
Spektrofotometrické plastové kyvety s objemem 1 ml s gumovými zátkami
Chemikálie:
9
0,1 M Na2S2O4
0,01 M cyt c
0,01 M DCIP (dichlorfenol-indofenol, 2,6-dichlor-N-(4-hydroxyfenyl)-1,4-benzochinonimin)
0,01 M xantin – 17,4 mg xantinu rozpustíme v 0,1 ml 1M NaOH a následně přidáme 9,9 ml vody do
výsledného objemu 10 ml
0,1 M sodno-fosfátový pufr (pH 7,0)
Xantinoxidasa (mléčná)
Argon v tlakové lahvi
Návod k měření a zaznamenání spekter:
1. Zapneme hlavní vypínač na počítači a spektrofotometru UV-VIS Ultrospec 2000.
2. V přihlašovacím okně napíšeme win.
3. Správce programů → SWIFT Bio-ws → File → Open → Parameters → redoxtit.ws1
4. Run → Standard → Samples = 10 ⇒ OK → File already exists! Overwright? ⇒ Ano → Load
Reference ⇒ OK → Load sample 1 - 10 ⇒ OK v intervalu po 3 minutách
5. Post-Run → Data points (recorded spectrum 0-9), v případě standardů (recorded spectrum 0-
3)
Postup:
0,1 M sodno-fosfátový pufr (pH 7,0) a kyvetový prostor spektrofotometru temperujeme na 25 °C. Do
kyvety o objemu 1 ml odměříme 900 μl 0,1 M sodno-fosfátový pufr (pH 7,0), 3 μl 0,01 M cyt c
a 0,01 M DCIP, 90 μl 0,01 M xantinu. Horní vstup kyvety zavřeme gumovou zátkou a bubláme roztok
argonem po dobu 10 minut. Zátku utěsníme parafilmem. Kyvetu s vytlačeným vzduchem přeneseme
do kyvetového prostoru spektrometru, v kterém jsme napřed zaznamenali spektrum samotného
pufru jako referenci. Následně zaznamenáme v čase 0 min spektrum číslo 1 roztoku v anaerobní
kyvetě a redukci cyt c a DCIP nastartujeme přidáním 4 μl xantinoxidasy Hamiltonovou jehlou.
Postupně v časových intervalech po 1 minutě zaznamenáme 9 dalších spekter. Odečteme absorbance
pro minimálně 6 různých vhodně vybraných vlnových délek (např. 450, 458, 535, 550, 565, 600, 635
nm).
Analýza směsi dvou redoxních párů vyžaduje, abychom měli k dispozici i data pro separátní
oxidované a redukované standardy. Pro DCIP nebo cyt c odměříme do kyvety 897 μl sodno-fosfátový
pufr (pH 7,0), 90 μl 0,01 M xantinu, 3 μl 0,01 M cyt c nebo 0,01 M DCIP a zaznamenáme spektra
oxidovaných forem. Spektra redukovaných forem zaznamenáme v uspořádání 887 μl sodno-fosfátový
pufr (pH 7,0), 90 μl 0,01 M xantinu, 0,01 ml 0,1 M Na2S2O4 a 3 μl 0,01 M cyt c nebo 0,01 M DCIP.
10
Odečteme absorbance pro minimálně 6 různých vhodně vybraných vlnových délek (např. 450, 458,
535, 550, 565, 600, 635 nm).
Vyhodnocení:
Do tabulky uvedeme absorbance pro vybrané vlnové délky oxidované a redukované formy cyt c a
DCIP, absorbance směsi, v které probíhala redoxní reakce a molové zlomky cyt c a DCIP vypočtené dle
návodu v obr. 2 v programu Microsoft Excell. Dosazením do neupravené rovnice 3 vypočítáme
standardní redoxní potenciál cyt c. E7
0
DCIP je +0,217 V pro dvouelektronový přenos (n = 2).
Protokol:
Tabulka s naměřenými absorbancemi pro vybrané vlnové délky a vypočítanými molárními zlomky pro
DCIP a cyt c.
Výpočet standardního redoxního potenciálu cyt c a srovnání s tabelovanými hodnotami a hodnotou
získanou metodou redoxního pufru.