ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD O D O D O _2. " " O D O D O
MASARYKOVA UNIVERZITA
ODODOuwuODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo □ ooooodododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo
BHP   I T™^% I ministerstvo školství, OP Vzdělávání ~%?^JfJ?
ododododododo dodododododod
ododododododo INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
Design sekvence PCR primerů
Hana Konečná
CEITEC - MU Centrální laboratoř - Proteomika Přírodovědecká fakulta NCBR
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
mUf     - cd
^^™>^^™ ^S^J I MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání
EVROPSKÁ UNIE ^■■JF ■ mládeže a tělovýchovy pro konkunmcMchopnort
ododooodododo dodododododod ODODOnononono
dodododododod
o □ o □ o z. C-'7 o □ o o o
OnODOuv^uODOOO □ ODODODODODOD ODODODODODODO
I (MJ *  MASARYKOVA UNIVERZITA
PCR primery
definice aplikace modifikace syntéza
design sekvence zásady navrhování software OLIGO 7 praktická ukázka
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, mládeže a tělovýchovy
as
evropská unie h
INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
OP Vzdělávání pra konkurenceschopnost
ODODODODODODO DODODODODODOD
ÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍ°Í     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
oligonukleotid
orientace! polymeráza!
)H
5' end HJ
krátká jednořetězcová struktura DNA nebo RNA (event. PNA, LNA. hydroxyl na obou koncích (normálně na 5'- konci fosfát)
oligonukleotid
á í   ■ \        F | ■ II J_ ' I
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
	g	1	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
Aplikace syntetických oligonukleotidů
• primery pro syntézu komplementární DNA
PCR, Real-Time PC R
• syntéza genů a rekombinantní proteiny
• hybridizační sondy pro klonování
• místně cílená mutageneza
• sekvenování a genetické profilování
• diagnostika-testy a biosensory
• gene arrays
• blokace genové exprese antisense oligo
• potenciální léčiva a DNA vakcíny
• NMR studia interakcí DNA-protein
• strukturální rentgenová analýza NA
3ie6nfuoo
OODODODODODOD ODODODODODODO
□ ononODODOnon ononooonODODO
□ OnononODODOn
(X.
a
_0-d = 0
(jeßns)
aßp|jq JS}saipogdsoL|d
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j>|no
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80Z8J8J 80U0>|
0OB>l!i!PO|A|
ODODODODODODO
ODODODODODODO
zD-mnui-MMM VllZ^3AINfl VAO>IAWSVW     i ISISISI i 1111
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
□ ODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD
ODODODODODODO _
onononononono
Modifikace na 5'- konci
postsyntetické modifikace
sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO □ ODODODODODOD
5'
fosforylace
aminoskupina
thioskupina
digoxigenin
biotin
enzymy
psoralen
akridin
cholesterol
fluoresc. barviva
zhášedla
2,4-dinitrofenyl
TBR-chelát spacer větvení blokáda
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
Modifikace na 3'- konci
3'
derivatizovaná matrice fosfát
thioskupina —- aminoskupina spacer akridin —- biotin —► fluorescbarviva —- zhášedla cholesterol 2,4-dinitrofenyl
□ OdodododOdOd odododooododo
□ ODODODOnonon
ODODODODODOnO
□ODODODOnonon
jeuit)dv/9su9s
esuesguv
no}!A|}>|B no>|0!}Á|B}B>| s
euiXzoq;^
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
□ onononononon
ODODODODODODO
□ ODODODODODOD
(xe|dijj) eue6řjuv
p>|unj ju|bujjou Lioifeí eínqiquj noqzBA • VNQ oqsu VNíd n}U9w69S >| juje}U9W9|dwo>| .
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P!i09|>|nuo6!|0 3SN3SI1NV
ODODODODODODO
zD-mnui-MMM VllZ^3AINfl VAO>IAWSVW     11IIII1111111
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO DODODODODODOD
iiiiiiiiliiii     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
TGľapGUtika —* nedegradována nukleázami!
modifikace fosfodiesterové vazby
0 = P^S"  i O = P /CH
O = P-^ííalkyí)
i v—y i v_i^ |
phosphorothioate        methylphosphonate phosphoramidate
S "CH2 "O
l I  * I
CH2 H3C-N 0 = P-BH,
l 3     I 1 3
3-thioformacetal methylene(methyliminio) boranophosphate
D ^^^^^^^^^^^^^^^^
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ODODODODODODO
□ ODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
OLIGONUCLEOTIDE AND PEPTIDE PRODUCTS FROM EARLY DISCOVERY TO LATE-STAGE DEVELOPMENT & COMMERCIALIZATION    J*?-' *
TIDES 2018 is coming to Boston!
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO □ ODODODODODOD
ododododododo dodododododod
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
dodododododod ododododododo
Degenerované oligonukleotidy
kod baze
symbol AA nukleotidy
M
				
cmfno acid	amino ocid symbol	nucleotide sequence (with degeneracy)	complement (for designing reverse primers)	
methionine		AJG	T AC	
tryptophan	w	JGG	ACC	
cysteine	c	JGY	ACk	
aspartic acfd		GAY	ctr	
glutamic acid	e	gar	CJY	
phenylalanine	F	TTY	AAft	
histidine	H	CAY^	GJk	
lysine	K C	*AAft^)	TTY	
asparaqine	N		TTf>	
qlutainme	q	car	GTY	
tyrosfne	v	tav	atr	
isoleucfne	r	ATM	TAb	
Alanine	a	gcn	c6n	
glycine	G	GGN	ccm	
prolme	p	ccn	ggn	
threonine	T	acn	TON	
valine	V	gtn	can	
leucine	l	y~n\i	ran	
orginfne	r	aagn	kcn	
serfne	s	wsn	w5n	
uuuuuuuuuuuuu
w
K
V
H
B
N
A or C (Á or G)
zahrnuje
A or T
C or G
C or T
G or T
A or C or G
A or C or T
A or G or T
C or G or T
G or A or T or C
G or A or T or C
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
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o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
Degenerované oligonukleotidy
CODEHOP
Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers
HYDEN
HighlY DEgeNerate primers
2-deoxyinosin
□ OdodododOdOo odododooododo
□ ODODODOnonon
ODODODODODOnO
□ODODODOnonon
M	A or C
R	A or G
W	A or T
S	C or G
Y	C or T
K	G or T
V	A or C or G
H	A or C or T
D	A or G or T
B	C or G or T
N	G or A or T or C
X	G or A or T or C
o	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O		
□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□		
o	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O		
□ o	O □	□ o	o □	□ o	O □	□ o	O □	□ O	O □	□ o	O □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
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o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
n	n	o	n	n	n	n	n	n	n	n	n	n		
Degenerované oligonukleotidy
Příklady:
ACG TAC G TA CGT ACG TAC nedegenerovaný
ACG TAM GTA CGT ACG TAC M = A/C
ACG TAC GTA CDT ACG TAC D = A/G/T
ACG TAC GTA CGT ACG NAC N = A/C/G/T
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
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Real-Time PCR
• 2x značená sonda
• REPORTER
• QUENCHER
nOHWARD PPIMĽP.
ncvcpic Pllľ/ĽP
2, Strand displacement: When the probe is intact, the reporter dye emission is quenched.
r i a1
5_9,
ľ ľ
□ ODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
3, Cleavage: During each extension cycle, the DNA polymerase cleaves the reporter dye from the probe.
r-a-
■■-r
-*- B'
4, Polymerization completed: Once separated from the quencher, the reporter dye emits its characteristic fluorescence.
ľ
B'
ododododododo dodododododod
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
dodododododod ododododododo
Peptidonukleová kyselina pna
N-terminal
nenabitá molekula vazba k DNA/RNA
N-(2-aminoethyl)-glycin
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
HN
O
r
Repeat J Unit
C-terminal
j. i
s v
v.
DNA 3'-end
ododododododo dodododododod		
ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□ o d o d o
LNA
Locked Nucleic Acid
2'-0, 4'-C methylenový můstek potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjimečná biostabilita
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
ododododododo
OLIGONUKLEOTIDY
• organická syntéza
na pevné fázi žádný enzym!
• od 3'- konce k 5'- konci
• bezvodé prostředí
EXPEDITE 8909
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
u u u u
Syntéza oligonukleotidu
O —i, — o —
syntéza na pevné fázi od 3'-konce k 5'-konci bezvodé prostředí
DMT- O
on ^
Step 4. Oxidation
Stepi. Deblock.-n g
DMT- O
N
- O — p _o     1_ Q _
I \
OR
Step 2. Coupling
DMT- O
OR
♦ Tetruole
ododododododo □ odododododod
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
ododododododo
F V V
VYTEZEK
1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 Yield o.500
0.400 0.300 0.200 0.100 0.000
□ □
II
-Q
-Q
□
tJ
□
U
Efficiency
■ 0.995
■ 0.990 □ 0.980
0    10  20  30  40  50  60  70  80  90 100 Oligonucleotide Length
PAGE
dodododododod ododododododo
ododododododo dodododododod
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□ odododododod ododododododo
PURIFIKACE a QC
Sephadex minispin kolonka RP cartridge HPLC
Gelová elektroforéza
s ■
os-
OOI
S'Z
0*0
OO'O
S0"0
•01*0
sro
Trto'OZ - otq-frCT SE    0£    SZ    OZ    ST OT
os-
001
■SO'O
•00*0
-01*0
STO
m u 0 9 3
□ odododododod ododododododo
□ odododododoo ododododododo
□ OQOdOoododod
SOJdOd     juaqjos Q~|dH £P!sep|
aijBjßoieujojqo juznpsd
ODODODODODODO
ODODODODODODO
zD-mnujMMM vnz*GAiNn vao>iawsvw lilillililiii
ODODODODODODO □ ODODODODODOD ODODODODODODO
Jaký typ purifikace vybrat?
• aplikace oligo
• délka oligo
• modifikace oligo
• výtěžek oligo
PCR nebo sekvenování standardní odsolení
Klonování. Mutageneza . Gel shift *       HPLC . cartridge . PAGE
Modifikované oligonukleotidy
□ OdODODOnonon
ODODODODODODO
□ ODODODODOnOD
* affinity electrophoresis for protein-DNA or protein-RNA interactions
22
ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo
ododododododo
MASARYKOVA UNIVERZITA
www.muni.cz
OLIGONUKLEOTIDY
PCR primery
ododododododo
ododododododo dodododododod		
ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
ododododododo
DESIGN OLIGONUKLEOTIDU
• manuální
• počítačový
www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/PCR_
Primer_and_Oligo_Design_/index.html
Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primem
• vysoce specifické - zejména 3'konec
• netvoří dimery a vlásenky
• stabilní duplexy s aktivní sekvencí
• nepříliš stabilní 3'-konec
• obvykle 18 - 25 nt
• 40% až 60% GC
www.genomecompiler.com/tips-for-efficient-phmer-design/
ododododododo dodododododod
ISIiIiIiIiIiI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
dodododododod ododododododo
ododododododo
(g)
OLIGO 6
PCR primery, hybridizační sondy sekvenační primery
OLIGO 7 (od roku 2008)
TaqMan sondy primery pro nested PCR molecular beacons siRNA
Oliqo 7 Power Point Presentation http://www.oligo.net/tutorials.html
ODODODODODODO DODODODODODOD
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□ ODODODODODOD ODODODODODODO
Terminologie PCR primem
forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna
pos:     350      tm: 57.1	
	
CCTGGCTíTGACTACTCA ►>■►►*■......►......►......►   ►   ►   ► i	hhhhhhthhth
	
TTAATGC CTG G CTGTGACTACTCAC E E E E EAAGGATGGTATTGAGC CTATGTG G G AAG A GAGAAAAACAAAC GGGGAGGACGATG G CTAATTACATTGAACAAACWSCAíACACG AACTÍACC C	
AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTC11111GTTTGCCCCTCCTGCTACCGATTAATGTA;	tCTTGTTTGTC GTCTCTG CTTC ACTG G AG
	
	
LHPGCQY5   L   F   K   D   -G   IE   P   M   i   E   DE   KNKRGGRi ITL	N   K   Q   Q   R   R   5 DL
UPPER - FORWARD - LEFT 5'-►
+ 5'-- 3'-
DODODODODODOn ODODODODODODO DODODODODODOn ODODODODODODO DODODODODODOD
■ 3'
■ 5'
5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
ododododododo dodododododod
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□ odododododod ododododododo
ododododododo
Terminologie
forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna
pos:
350
tm: 57.1
,Ittt,         , i 270 _	,,200,        .itt1?,,         100                             120 110	110           100 170
		
		
TTAATG C CTG G CTGTGACTACTCAC1	111IAAGGATGGTATTGAGCCTATCTG G GAAGATGACAAAAACAAAC GGGGmGGACGA GG CTAATTACATTGAmCAAAtACtACACAt CAACTCAt t C	
AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG CCCCTCCTGCTACC GATTAATGTAACTTGTTTGTC GTCTCTG CTTCACTG GAG		
H                   H                   H                   i                   H H	< ACTC G GATACAC CCTTCTACTC	
		
LHPGCQY5 L	FKDCIEPHWEDEKNKRGGRW ITL	NKQQRR5DL
UPPER - FORWARD - LEFT
5' » polymeráza
+ 5] ^=^=| 3'
- 3'-
5'
polymeráza * 5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
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	g	1	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
Nasedání PCR primem
pos:     350      tm: 57.1	
,,260,           ?73           , 2G0 _           ?33             300             l. 3             3?0 33Ü	l<3 ÖG3
	
	
TTAATGCCTGGCTGTGACTACTCACIUIIAAGGATGGTATTGAGC CTATGTG G GAAGA GAGAAAAACAAACGGGGAGGACGATGGCTAATTACA   GAACAAAtAGtAGAGACGAAGTGAtt C	
AATTACG GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTCCTAC CATAACTC GGATACACCCTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C GATTAATGTAACTTGTTTGTC GTCTCTG CTTCACTG GAG	
.........ACTC G GATACAC CCTTCTACTC	
	
LMPGCDY5LFKDGIEPMÍEDEKNKRGGRW ITL	N   K   Q   Q   R   R   5   Q L
UPPER - FORWARD - LEFT
5'
+ 5'-- 3'-
3' 5'
5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
□ OdodododOdOö odododooododo
□ ODODODOnonon
ODODODODODODO dodododododod
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
	g	g	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
5'CTTCTGCTCAATCTTTCTAC 3' FORWARD
+ C ' 1 atggíttctg ctcaatcttt cta(jaaccaa agctctgtct tgaaaatcaa
51 tgtcai gg i i g iggalga i g a i latgtttt ccttgatatc atgtcacgca
101 tgcttcaaca ctccaaatac agaggtaatt aaatattatt atcatattat
151 atataatatg ttattgattt tttgtttgtg atttcattta gatttttatt
201 tctatgattt cttagcatga aatacaattt ttggagaaac aactagcagt
251 tttaaaaaca aaacttgaat tttgagaaat tcaaagatgt tatatatata
301 tgtcaaaatt taacaattat tcttctaaat catccggatt ccgtttacat
351 gtacacatct acaattttca attgaggtat tcttgttttg atgcctttga
401 gacgaatagt ttgattgata aaaaaaattc taaccaatat gatatataaa
451 gtttattttc tttttgtcaa accatacttt atactatgta acttttttaa
501 gagattattg aaaatagttt atttataaaa tagtaaccta ttgttgaatt
551 AAAAAAAAAA AAAAAATTfiT AAATffVmTT TGCAAACGAC atgtgattta
601 tcttagttta! aaactagctg atattcttcaiaatcgactgt tcttataagt
651 aatcaaccaa'ttaocatcaa tcacaataaa ttgtaaacac ttcaatgaaa
701 atggtgattt taaagaatat gttttactta tgttatgaac tatctcaaat
751 ttgtgaaata tttcataact aatgtggaaa actatataac ccctccatac
801 aaaacgtaag taaaatttat gaaatcctat catttttaaa ggttaaacca
851 atcaaaaagt aataattctt ggtacttgca atatttttgt cattatattt
901 tagtttatta attttatttt gattaaatgg ttttagatcc atcagttatg
951 gagatcgcag ttatagctgt agacgatccg aagaaagcat tatctactct 1001 aaaaattcaa cgagacaata tagatctcat aatcacagat tattatatgc 1051 ctggtatgaa cggtttacaa ctcaaaaaac aaatcactca ggaatttgga 1101 aatttaccgg tcttaggtaa cattttttgt tctttacaac ttaaattaaa
3'
5' TGA-AGA ATA TCA GCT AGT TT 3' REVERSE
ODODOaooonono □ ODODOnononon ODODOnononono noDODODononon
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
□ ODODODODODOD
m
1
	111 iy55y»H)l303iWd3I50)ldlSAG35dWl
	
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[I YD D1DV011D D1D1D1D           J_LD WIDlWilVD D DV1D DID DID D D D D11191 1 1 1 1D1DV1D J_LD D DVDY1VD D D1DW1VD DV1D D JJJtfVWVDID VD1VD1DVD YD D D YD D D YLLYY	
JJJ)VDVDDVDWi1 J iiY J YllW13001 V*)D¥ 3 HVH [ H [i J     WVVVTOTOlVn WH H niMVlJ^TOilVI'BirBVV 11111 DVOiDYlDYDiDiD^DlDDDlYVll	
	
	
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ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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o □ o □ c
□ ono: o □ o □ c
□ ono: o □ o □
OO
Search for Primers & Probes
—
Search Options Subsearches
Search in: iVf + Strand 5? - Strand Search Mode: @ Select Verify
5? Complex Substrate
® PCR Primers
Compatible with the      Forward Primer   Q Reverse Primer
0 TaqMan Probes & PCR Pairs Compatible with the      Upper Probe
w Lower Probe
0 Molecular Beacons & PCR Pairs O Nested Primers
Sequencing Primers C Hybridization Probes
siRNA Probes
After successfull search show:   All Results
Search
( Cancel ) (    Apply )
i Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults )
\J    U LJ    W    LJ \J
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e
Search for Primers & Probes
c c c
ľ.
r
Search Options Subsearches
Search method: Compatible Pairs
^ Eliminate Ambiguous Bases
B Duplex-free Oligonucleotides
3 Highly Specific Oligonucleotides (3'-end Stability)
□ 5'-end Stability
_ siRNA Internal Stability
Oligonucleotides with CC Clamp 'V^ Oligonucleotides within Selected Tm Limits @5 Hairpin-free Oligonucleotides
El iminate Mono- and Di-Nucleotide Repeats & Detect Sequence Repeats @ Eliminate Frequent Oligonucleotides !?! Omit High Secondary Structure Regions in the Template ^ Check Primers/Probe Sequence Constraints 5? Restrict the Number of C Bases 'Vf Eliminate False Priming Oligonucleotides and _ Continue Above Search in Other File(s)
Consensus Primers
i	Search	)
		
(	Cancel	)
		
(	Apply	)
' Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults )
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
PCR
~1
filc: lutrľ.n 4Lscq
5
Optimal Annealing Temperature: 50.S °C (Max: 66.3 °Q
	Position and Length		Tm rq       GC N		P.E.#	Score
Product	S62		7S.9	29.6	n/a	697
Forward Primer	91S	22	56.9	45.5	471/47L	S40
Reverse Primer	L7S3	21	55.3	29.6	4S9 / 4S9	834
Upper Ol i go	979	24	56.5	33.3	479 / 479	9L7
Lower Oligo	L694	23	55.4	39. L	457 / 457	84 L
Product Tm - Reverse Primer Tm: 23.6 °C
Primers Tm difference: L6 °C
Comments:
	Concentration	
Forward Primer	200.0	nM
Reverse Primer	200.0	nM
Upper Oligo	200.0	nM
Lower Oligo	200.0	nM
Monovalent Cation	50.0	mM
Free Mg[2+|	0.7	niFV
Total Na[+] Equivalent: L55.S mM
ododododododo dodododododod
lillllllilll!     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ odododododod ododododododo
o d o d
dodo
eeo
Selected Primers
Tile: GRCA2 gene.seq
=1
AY436640:1543SF22		AY436640:15917R20	
5' CAATATATA C C CTA CTC C C CTA 3'		5' CACCTACATATTAC C C C A C A 3'	
Length:	22-mer	Length:	20-mer
Score:	802 points	5core:	914 points
5' Position:	1S438	3' Position:	15917
Tm/tm: 53.4	52.6 °C	Tm/tm: 53.1	53.8 °C
AC/Ag (25 aCy. -30.5	-29.2 kcal/mol	AC/Ag (25 *C) -28.6	-2S.5 kcal/mol
A5/As:                     -472.1	-449.5 cal/°K*mol	AS/As:                     -430.S	-419.6 cal/'K * mol
AH/Ah: -171.3	-163.2 kcal/mol	AH/Ah: -157.0	-153.6 kcal/mol
3'AC:	-6.5 kcal/mol	3'AC:	-6.9 kcal/mol
Degeneracy:                              ^ ml		Degeneracy:	1
P.E.#:	(443/443^	P.E.#:	M77/47^
1/E:	4.fTi nmol/A2go	1/E	STTT3 nmol/A2G0
31.1 M9/A2GO		31.0 M9.'A2G0	
Priming Efficiency PE Score
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
Sekundární struktury     • HAIRPIN intramolekulární
• DIMER intermolekulární
Hairpin
y ÖGGAAA^i I III
5' TATCTAGGACCTTA-
3' GGGaA^ II   I A 5" TATCTAGGACCTTA-^
Self-Dimer
8 bp
3 '   gggaaaattc c aggatc tat    51
I I I I    I I I I
51   t ATC TAG GAC C tt AA A AGGG 3'
4 bp
3' gggaaaattc c aggatctat 5' I i i i
5 1   t atc t aggac c tt a a a aggg    3 ■
Dimer
forward printer 5'   tatc tag gac c ttaaa aggg 3'
3' c atggaaac g taggagac 51 reverse primer
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ododododododo dodododododod
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ odododododod ododododododo
ododododododo
HAIRPIN intramolekulärni DIMER intermolekulärni
eoe	Current Oligo Duplexes	
File: 0RCA2 gene.seq		
Current Oligo ZL-mer [5042]
[Currents Oligo! - The most stable B'-dimer: £ of hydrogen bonds = 10: AC = -0.7 kcal/niol
5"  GAATTAGATAAArrCAAArrA 31
III   II   II III 3 r ATTAAACTTAAATAGATTAAG 5 r
[Current- Oligo! - The most stable E'-dinier: *or" hydrogen bonds = L0: AC = -7.3 kcal/mol; Tm = 2.91
5r TAArrrGAATrrATcrAATTC a' I I I I I        I I I I I
3"   C TTAATi: TATTTAAt] TTTAAT 5"
The most stable dimer overall: # of hydrogen bonds = L0: AC = -7.4 kcal/niol; Tm = 2.2DC
S'   GAATTAGArAAATTHAAATTA 3'
I I I I I I I I I I
3 '  ATTAAAC 77/YAATAt] ATTAAt] 5 1
Hairpin: loop ■ 5 nt; AC = -3.0 kcal/mol; Tm = 54.6 °C
5 1 GAATTAG-,
I I I I I A 3 r ATTAAACTTAAAT -
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
608   Reverse Primer False Priming Sites
File: M13MP18
Reverse Primer M13MP18 6310R19 (positive strand)
Priming efficiency of the perfect match is 482 (above the threshold)
Priming efficiency 482 (above the threshold)
5'(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
II Mill lllllll
3*(6328)  ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5'
Priming efficiency 244 (above the threshold)
5'(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
III   I I I I MINI 3'(626)  agcaaatggtc—tgctgc (610)5'
Priming efficiency 193 (above the threshold)
5'(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
III     I I I I   III III 3'(5125)   ictaaglggtcagtg-tgc (5108)5'
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	g	g	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
AHP2 cDNA (TAIR database)!
Sequence: AT3G29350.1 Date last modified 2007-04-17 Name AT3G29350.1 Tail Accession   Sequence:4010737427 Sequence Length (lip) 827
1 ACAATTCGCG AGAAAGACAA AACACAAGTT TCTTCTTCTT GGGATTGGCT 51 ATTTCCAGAA ATCCAAGTCA ATAATCAAAG TCCAAACAAA AAAATCCTCT 101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA AC T AAA GAGA 601 CTAGTCCATA AGAAGAAAAA AG AT GATGAC TTTCTTTCTT TAGTTTCTCT 651 TCTAAATTAT TTTGGATTTG GTGTTTGCTC AAAAACTCAA TAAAATATGT 701 GCAAAAAGAA ACAAAAACAA GTGATGGTTG TTTATAAATC AGTAGTATGT 751 ATTGTTTGAT CTCATCCGAG AAAATTGAAA CCATTGGACT AATGAATGTG 801 ATGATAATAT ATATTGGTTT GCTTCTG
□ ODODOnononon onononononono noDODODononon
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
ododododododo
101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA ACTAAAGAGA
EcoRI restriction site
5 ......GIAATTC......3
3"......CTTAA G......5'
Design of primers
AHP2 ex_np
5'- CCG GAA TTC ATG GAG GGT CTC ATT GCT C AG - 33
AHP2ex_low
5'- CCG GAA TTC TTA GTT A AT ATC C AC TTG AGG - 3'
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
ododododododo
101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTQVTGGAC GCTCTCATTG CTCÄČJCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAC 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTfľCTCAA GTGGATATTA ACŤÄ^AGAGA
EcoRI restriction site
5'......G| AATTC......3
3"......CTTAA G......5
Design of primers
AHP2ex_up
53- CCG GAA TTC ATG GAG GCT CTC ATT GCT C AG
33
AHP2ex_low
5'- CCG GAA TTC TTA GTT A AT ATC C AC TTG AGG - 3'
ododododododo dodododododod
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dodododododod ododododododo
ododododododo
LITERATURA
■ PCR Primer Design; IMBB Workshop, N. Ndegwa (2013)
■ PCR Primer Design; A. Yuryev (2010)
■ https://lanqdalelab.files.wordpress.com/2015/07/deqenerate-primer-desiqn.pdf
■ OLIGO Primer analysis software, Version 7
■ Oliqo 7 Power Point Presentation http://www.oliqo.net/tutorials.html
■ PCR Primer: A Laboratory Manual (2003)
■ Artificial DNA: Methods and Applications; Khudyakov, Y.E., Fields, W.A., Ed. (2003)
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Discovery is not in seeking new landscapes, but in having new eyes...
Marcel Proust
Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomik:/'(CZ. 1.07/2.3.00/09.0132)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
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