Nukleové  kyseliny,  podklady  připravil  Dr.  Karel  Kubíček   1       Nukleové  kyseliny           2  Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček  27/09/2011   Nukleové  kyseliny     Doporučená  literatura:   1)  Neidle, S.: Principles of Nucleic Acid Structure, Elsevier, AP, 2008 2)  Calladine, C.R., Drew, H.R., Luisi, B.F., Travers, A.A.: Understanding DNA – The Molecule and How It Works, 3rd Ed., Elsevier Academic Press, 2004 3)  Bates, A.D., Maxwell, A.: DNA Topology, Oxford Bioscience, 2005 4)  Cotterill, R.: Biophysics: An Introduction, John Wiley & Sons, Ltd. 2002 5)  Voet, D, and Voetová, J.G.: Biochemie, Victoria Publishing 6)  Murray, R.K., Granner, D. K., Mayes, P., A., Rodwell, V., W.: Harper’s Illustrated Biochemistry, Lange Medical Books, 2003 7)  Schuenemann, V.: Biophysik: Eine Einfuehrung, Springer, 2005 8)  Garrett, R.H., Grisham, C.M.: Biochemistry, 2nd ed., 1999 9)  Bergethon, P.R., The Physical Basis of Biochemistry: The Foundations of Molecular Biophysics, 2nd ed., Springer, 2010     Nukleové  kyseliny   -­‐ DNA   -­‐ RNA   -­‐ PNA   Základní stavební kameny nukleových kyselin: 1)  Báze i)  Purinové – menší, číslování arom. kruhu protisměru hod. r., adenin (A), guanin (G), obecně Y ii)  Pyrimidinové – větší, číslování ve směru hod. r., cytosin (C), uracil (U), thymin (T), obecně P 2)  Cukr – 2’-deoxyribóza (DNA), ribóza (RNA) 3)  Fosfát Báze: 1)  Standardní 2)  Modifikované: N6-methyl-dA, 5-methyl-dC, xanthin, hypoxanthin, uric acid, 7methylguanine, dimetylaminoadenin 3  Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček  27/09/2011    Purin  (P)                Pyrimidin  (Y)   27/09/2011   4  Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   5   S=mulanty  obsažené  v  kávě  ,  čaji  a  čokoládě   jsou  metylované  puriny     Me=CH3   theophylline*   *  Obsažen  v  čaji,  ale  není  sQmulantem   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   6   Tautomerie  amino  (amin<-­‐>imin)  a  keto  (keto<-­‐>enol  forma)  skupin  purinů  a   pyrimidinů,  fyziologické  podmínky  favorizují  amino  a  keto  formy   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   7   Nukleosidy  a  nukleo=dy   Nukleo=d  vzniká  esterifikací  fosforylu  na  –OH  skupinu   nukleosidu.  V  riboze  lze  esterifikovat  3  skupiny  (ve  2’-­‐ deoxy-­‐riboze  pouze  2  –OH  skupiny)  ,  přesto  má  drQvá   většina  ribonukleoQdů  fosfát  v  poloze  5’.   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   8   Název  báze,  X=H   Nukleosid,  X=(deoxy)ribóza   NukleoQd,  X=  fosfo.ribóza     Adenin     Adenosin     Adenosinmonofosfát   AMP     Guanin     Guanosin     Guanosinmonofosfát   GMP     Cytosin     CyQdin     CyQdinmonofosfát   CMP     Uracil     Uridin     Uridinmonofosfát   UMP     Thymin     Thymidin     Thymidinmonofosfát   TMP   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   9   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   10   Cukr   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   11    AMP          dAMP                    UMP                    dTMP   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   12   Vlivem  stérického  bránění  báze  se  vyskytují  dvě  konformační  uspořádání  báze-­‐cukr:  syn/an%   Oba  způsoby  uspořádání  se  vyskytují  v  přírodě,  přičemž  ANTI  převažuje     27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   13   Konformace  cukru  -­‐  Sugar  pucker   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   14   Fosfát;  páteř  nukleové  kyseliny   Tetrahedrální  uspořádání  fosfátové  skupiny  (a),   volnost  rotace  (b)   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   15   Páteř  nukleové  kyseliny   náboj  2-­‐     1-­‐     1-­‐     1-­‐     proQnáboj  negaQvně  nabité   páteři:  Na+,  K+   Báze  v  páteři  nukleových   kyselin  číslujeme  od  5’-­‐konce   směrem  ke  3’-­‐konci:  5’-­‐GCAT-­‐3’   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   16    RNA                DNA   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   17    RNA                DNA   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   18   Párování  bází  NK:  Watson-­‐Crick,  NC  za  medicínu  a  fyziologii  1962  [Watson(*1928)]   Vodíkové  vazby   Jednotlivé  řetězce  dvojité  šroubovice  drží  díky  complementárními  vazbami  N•••H-­‐N  a   =O•••H-­‐N,  které  vznikají  mezi  Cytosinem  a  Guaninem  a  Thyminem  a  Adeninem.   Každá  vodíková  vazba  přispívá  cca  20  kJ/mol  ke  stabilizaci  dvojšroubovice   27/09/2011   19  Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   20   rozložení  náboje  v  nukleobázích  +  0  -­‐,  šipky  označují  dipólový  moment   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   21   Watson-­‐Crickovské  párování  bazí   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   22   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   23   Nejběžnější  typy  DNA:  B-­‐DNA  (a),  A-­‐DNA  (b),  Z-­‐DNA  (c)   DNA   konformace   B   A   Z   Směr  vinur   pravotočivá   pravotočivá   levotočivá   Počet  parů  bazí   na  otáčku   10.5   11.0   12.0   Průměr   šroubovice   ~2.0  nm   ~2.6  nm   ~1.8  nm   Konformace   cukru   C2’-­‐endo   C3’-­‐endo   C2’-­‐endo  (pyr)   C3’-­‐endo  (pur)   Velký  žlábek   Major  groove   široký,   hluboký   úzký,     hluboký   plochý   Malý  žlábek   Minor  groove   úzký,   hluboký   široký,  mělký   úzký,  hluboký   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   24   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   25   Stabilita  DNA  dvojšroubovice:     1)  Vodíkové  můstky   2)  Londonovy  disperzní  síly  (LDF),  dipól-­‐dipólové   interakce   3)  Patrové  interakce  –  stacking     Nukleopár   Vodíkové  vazby   LDF   Celková  E   A:T   -­‐26   +1.0   -­‐25.0   G:C   -­‐40   -­‐16.3   -­‐56.3   Energie  v  kJ/mol     A:T  –  opačné  dipóly,  G:C  –  působí  atrakQvně         Působí  mezi  jednotlivými  patry  nukleopárů,  stabi-­‐ lizují  dvojšoubovici  díky  elektronovým  korelacím,   van  der  Waalsovým  a  Coulombickým  interakcím   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   26   Non-­‐Watson-­‐Crickovské  (Hoogsteenovo  –  Karsten  Hoogsteen)  párování  bazí   Triplexové  struktury   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   27   Triplexové  struktury   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   28   Quadruplexové  struktury   Polymorfie  telomerických  opakování  in  vitro     Na+   K+   K+   K+   K+   Wang  et  al.  Structure  (1993)   Parkinson  et  al.  Nature  (2002)   Lim  et  al.  J  Am  Chem  Soc.  (2009)   Dai  et  al.  Nucleic  Acids  Res.  (2007)   Ambrus  et  al.  Nucleic  Acids  Res.  (2006)   X-­‐ray  NMR   NMR   Sekvenčně závislé K+/PEG   Heddi  et  al.  J  Am  Chem  Soc.  (2011)   Polymorfie  telomerických  opakování  in  vivo   Hansel  et  al.    Nucl  Acids  Res  (2011)   In-­‐cell  NMR   ?   X   Sekvenčně závislé 27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   32   Superhelikální  cirkulární  DNA     Lk  =  Wr  +  Tw     Lk  -­‐  linking  ()  –  topologická  vlastnost  cirkulární  DNA,  udává,  kolikrát  je  jeden  řetězec   DNA  obtočen  kolem  druhého  v  pravotočivém  směru  (vzhledem  k  tomu,  že  referenční  je  B-­‐ DNA).  Lk  zůstává  pro  danou  cirkulární  DNA  konstantní  (neboť  “konce”  jsou  zafixované  a   nemůže  docházet  k  rozvinur).  Lk  nabývá  vždy  celočíselných  hodnot  (konce  DNA   dvoušroubovice  na  sebe  musí  “pasovat”,  aby  došlo  k  uzavření  kruhu).   Tw  -­‐  twisLng  (otočení)  –  v  relaxovaném  stavu  se  Tw=Lk.  Tw    udává  počet  360°  otoček,   které  jsou  na  dvojšroubovici  podél  celé  kružnice.  Vzhledem  k  tomu,  že  pro  B-­‐DNA  připadá   cca  10  párů  bazí  na  jednu  otočku,  Tw  je  přibližně  rovno  počtu  párů  bazí  /  10.  Pro   pravotočivé  otáčky  je  Tw  kladné.   Wr  -­‐  writhing  (skřížení)  –  z  důvodu  strukturních  “potřeb”  DNA  různé  hodnoty  Lk   kružnice  mohou  způsobit  nikoliv  změnu  v  otáčkách  (Tw),  ale  vznik  superhelixu   (superšroubovice).  Vznik  superhelixu  je  definován  číslem  Wr.  Pro  pravotočivé   superšroubovice  je  Wr  záporné!!!     27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   33   Vzhledem  k  tomu,  že  má  DNA  tendenci   udržet  B-­‐DNA  topologii,  Tw  se  zvýší  zpět   na  42.  Lk  je  ovšem  topologické  číslo,   které  MUSÍ  zůstat  konstantní,  tedy  36  a   k      zachování  rovnice  Lk=Wr+Tw  Wr   musí  nabýt  hodnoty  Wr=-­‐6.   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   34   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   35   27/09/2011   Nukleové  kyseliny,  Karel  Kubíček   36