Richard Štefl @NCBR/CEITEC Biophysical Lab @Dept. Condensed Matter Physics Karel Kubíček Obsah semináře 1)  Úvod 2)  Hardware – magnet, konsole (spektrometr) 3)  Mĕření - Spiny 4)  Zpracování spekter 5)  NMR biomolekul 6)  Interakce měřené pomocí NMR 7)  Komplementární techniky 8)  Závěr NMR sample spectrum sample spectrum NMR NMR hardware 1)  Magnet 2)  Spektrometr 3)  Ovládací zařízení NMR spektrometr Magnetické pole země ~ 50µT Magnet - supravodivé solenoidy na bázi Nb a Sn ponořené do heliové a dusíkové láznĕ - He-lázeň ~4 K dále snížena J-T pumpou na ~2.1 K - v současnosti až 22 Tesla (Nb, Ta)3Sn supravodič o šírce 0.81 mm s 271 vlákny vnořenými do OFHC mĕdĕné matrice Díra cca 55mm He-plnĕní N2-plnĕní J. Emsley & R. Feeney, Progr.. NMR Spectroscopy 1995, 28, 1 ‘101945 60 1961 220 ‘65 1973 360 1979 500 1987 600 ‘92 750 1000 ‘97 2000‘68 decoupling decoupling TROSY FT and nD DNP in high fields SpectrometerFrequency[Hz] Time [year] Quench an abnormal termination of magnet operation Occurs when part of the superconducting coil enters the normal (resistive) state. This can occur i)  because the field inside the magnet is too large ii)  the rate of change of field is too large (causing eddy currents and resultant heating in the copper support matrix) iii)  or a combination of the two. iv)  a defect in the magnet can cause a quench. MOVIE NMR Sonda Spektrometr CBU Control board unit FGU Frequency gen. u. Shimms Temperature Unit AcquisitionCon troler Transmitter Spektrometr - přehled Signál - sl(t)=Σ sl(t) l Pulz – jak je generován Pulzy: a)  tvrdé – 7-30 µs@-3~+3dB b)  selektivní – ms~s@>30db c)  adiabatické Trocha NMR-teorie Isidor Isaac Rabi Nobelova cena za fyziku v r. 1944 “for his resonance method for recording the magnetic properties of atomic nuclei” Bloch & Purcell fyzika 1952 “for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith” Ernst chemie 1991 ”for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy” Wüthrich chemie 2002 “for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution” Rezonanční podmínka ω0 = -γB0 NMR - Refresh 1)  nuclear spin ≠ 0 (1H, 13C, 15N, 31P) - number of neutrons and the number of protons both even ⇒ NO nuclear spin - number of neutrons plus the number of protons odd ⇒ half-integer spin (i.e. ½, 3/2, 5/2) - number of neutrons and the number of protons both odd ⇒ integer spin (i.e. 1, 2, 3) 2)  ν=γ*B (1) - when placed in a magnetic field of strength B, a nuclei with a net spin can absorb a photon, of frequency ν. The frequency ν depends on the gyromagnetic ratio, γ of the nuclei 3)  from quantum mechanics we know that nucleus with spin I can have 2I +1 orientations ⇒ nuclei with a spin ½ can have two orientations in an external magnetic field– low / high energy N S N S N S E=h ν (2) Nuclear Magnetic Resonance Refresh From (1) and (2): E=h γ B N S N S Energy Magnetic Field N S N S Energy Magnetic Field Abs.E. Magnetic Field change field change frequency CW vs. Fourier transform NMR Problem of NMR the magnitude of the energy changes in NMR spectroscopy small ⇒ sensitivity is a major limitation Solution I. increase sensitivity by recording many spectra, and then add them together; because noise is random, it adds as the square root of the number of spectra recorded. For example, if 100 spectra of a compound were recorded and summed, then the noise would increase by a factor of 10, but the signal would increase in magnitude by a factor of 100 ⇒ large increase in sensitivity. However, if this is done using a CW-NMR, the time needed to collect the spectra is very large (one scan takes 2 - 8 minutes). CW vs. Fourier transform NMR Solution II. FT-NMR ⇒ all frequencies in a spectrum are irradiated simultaneously with a radio frequency pulse. Following the pulse, the nuclei return to thermal equilibrium. A time domain emission signal is recorded by the instrument as the nuclei relax. A frequency domain spectrum is obtained by Fourier transformation. FT time domain (FID – free induction decay) frequency domain RF pulse 90° 1) Larmorova frekvence spinu 2 > než spinu 1 2) Kapling J12 je pozitivní Jednokvantové přechody Dvoukvantový a nulkvantový přechod Frekvence tĕchto přechodů nejsou ovlivnĕny kaplingem mezi temito dvĕma spiny 2πJIS 2πJIS ΩI Ωs ωrf I S NMR spektrum jader I a S se spinem ½. Ωs a ΩI jsou rezonanční frekvence (rad/s), ωrf je budící frekvence a JIS je spin-spinová kaplingová konstanta. Transformace a (vybraná) pravidla produktových operátorů pro spinový systém IS vlivem skalárního kaplingu JIS, resonanční frekvence ΩI a v časové periode t. COSY – základní 2D experiment Obecnĕ všechny 2D experimenty: PřípravaàEvoluceàMixingàDetekce 90x 90x t1 t2 Zpracování NMR-signálu Zpracování NMR dat Okénkové funkce: 1) zvýšení S/N pomĕru 2) zvýšení rozlišení Exp Lor.-Gauss Kaiserova o. f.ce Zpracování NMR dat – okénkové funkce - apodizace Zpracování NMR dat – Zero Filling, Lineární predikce Lineární predikce Zero filling 240 bodů 64 bodů LP na 128 bodů LP na 240 bodů |nmrPipe -fn POLY -time \ |nmrPipe -fn SP -off 0.33 -end 0.98 -pow 2 -c 1.0 \ |nmrPipe -fn ZF -size 2048 \ |nmrPipe -fn FT -auto \ |nmrPipe -fn PS -p0 -76.0 -p1 0.0 -di \ |nmrPipe -fn EXT -x1 11.0ppm -xn 6.0ppm -sw \ |nmrPipe -fn POLY -ord 3 -auto \ |nmrPipe -fn TP \ I)  Potlačení solventu II)  Okénková f.ce III)  Zero-filling IV)  FT V)  Transpozice F2 Zpracování NMR dat – shrnutí NMR coby nástroj pro studium struktury a dynamiky biomol Báze nukleových kyselin i)  purinové ii)  pyrimidinové EtOH protein Každý vodík (proton) = 1 NMR signál Každý (nevyměnitelný) vodík (proton) = 1 NMR signál Wε -NH -NH/-NH2/arom Hα Hβ -CH3 H2O Každý (nevyměnitelný) vodík (proton) = 1 NMR signál NMR Komplexní metoda: 0) Příprava vzorku a) Mĕření b) Zpracování c) Interpretace - přiřazení rezonančních frekvencí - zmĕny chem. posunu vlivem interakce - dynamika - strukturní výpočty d) Strukturu nevidíme (přímo) !ale počítáme! e) X-Ray, NMR, cryoEM f) Moderní výzkum je komplexní => nutnost užití i jiných fyzikálnĕchemických metod Samples: 1)  Small organic molecules - synthesis - costly 2)  Peptides (10-40 aa) - synthesis - costly 3)  Proteins (40-200 aa) - 13C/15N enriched media - costly 4)  Large proteins > 200 aa - 2H/13C/15N enriched media -pretty costly If high concentrations (>10mM) can be used measurements in natural abundance can be performed and the sample goes from costly to affordable 15NH4Cl, 37oC 13C-glukosa supernatant odstraníme odstředěním ultra- centrifugace Nuclear Overhauser Effect (SpectroscopY) = NOE(SY) i)  caused by dipolar coupling between nuclei. ii)  the local field at one nucleus is affected by the presence of another nucleus. iii)  the result is a mutual modulation of resonance frequencies. iv)  the NOE operates through space. v)  the intensity of the interaction is a function of the distance between the nuclei according to the following equation: I = A(1/r6), I is the intensity, A is a scaling constant, and r is the distance between the nuclei vi)  the NOE provides a link between an experimentally measurable quantity, I, and internuclear distance vii)  NOE is only observed up to ~6Å N N SS MRI je taky NMR