Oddělení vývojové genetiky rostlin Biofyzikální ústav AV ČR Prof. Boris Vyskot RNDr. Roman Hobza, PhD Doc. Eduard Kejnovský, CsC RNDr. Bohuslav Janoušek, PhD Zdeněk Kubát, PhD Radim Čegan, PhD BFÚ AV ČR, Královopolská 135, Brno www.ibp.cz Oddělení vývojové genetiky rostlin Biofyzikální ústav AV ČR Repetice a mobilní elementy Evoluce pohlavních chromozomů Epigenetické mechanizmy Aplikovaný výzkum Evoluce determinace pohlaví a pohlavních chromozomů Gitschier, 1993 Předpokládané funkce chromozomu Y Skutečná struktura chromozomu Y ? ? © Sexmise rod Silene A A X Y X Y Y1 X Y2 X Y 1 mil. let 5 mil. let 170 mil. let15 mil. let PAR PAR PAR PAR Stadia evoluce pohlavních chromozomů papája silenka šťovík človíček Hermafrodit/ jiný typ determinace pohlaví PAR Co se děje s pohlavními chromozomy? Mechanizmy změny velikosti chromozomu Y Geny pro determinaci pohlaví Degenerace genů na Y Redukce počtu genů na Y Kompenzace dávky genů na X X Y Mobilní elementy (transpozony) a Epigenetika Vyberte organismus s největším genomem Trichoplax adherens Drosophila melanogaster Polychaos dubium Paris japonica Genlisea aurea Pšenice Myš Člověk Organismy podle velikosti genomu Trichoplax adherens 0,098 Gb / 11 tis genů Drosophila melanogaster 0,14 Gb / 17 tis genů Polychaos dubium 670 Gb (67 Gb) Paris japonica 150 Gb / 17 tis genů Genlisea aurea 0,064 Gb / 17 tis genů Pšenice 17 Gb / 110 tis genů Myš 2,6 Gb / 20 tis genů Člověk 3,3 Gb / 20 tis genů Velikost genomu a komplexita organismu Člověk: transpozony 70 % geny 1-2 % jádro cytoplazma DNA transposon „cut and paste“ Mobilní elementy (disponují vlastním aparátem pro transpozici) transposaseTIR TIR Gag/Pol PR RT IN IN PR RT GAG VLP Reverzní transkripce jádro cytoplazma mRNA translace transkripce integrace IN IN ININ LTR retrotransposon „copy and paste“ DNA transposon „cut and paste“ gag pro rt rnaseH int eORFPBS PPTLTR AAAAAAAA LTR retrovirus transposaseTIR TIR Havecker et al. (2004) Mobilní elementy (disponují vlastním aparátem pro transpozici) B A C Transposon Gen X Nefunkční protein Transkripce v jiném typu buněk Bez efektu Jaké jsou důsledky aktivity transpozonů? A B C Genetické choroby Rakovina Jak organizmy své transpozony regulují? Epigenetické mechanizmy Transkripční umlčení Posttranskripční umlčení Transkripční umlčení A – T – C – G – T – A – G – C – …… …… ……… ……… Metylace DNA de novo metylázy udržovací metylázy demetylázy Metylace DNA reverzibilní biologický signál Zapnuto Vypnuto FISH: Většina rodin TE má neobvyklou distribuci na pohlavních chromozomech silenky a šťovíku Distribuce i počet kopií TE v genomus se liší mezi evropskými populacemi téhož druhu Model Model pohlavně specifického šíření TE u rostlin ! Prokázali jsme scénář B ! Počítání kopií Ogre CL5 v samčích a samičích genomech: Počet kopií na X je 1,5-2 x vyšší než na A. Puterova et al. 2018 Mají transpozony také pozitivní vliv? Transpozony mohou být „domestikovány“ - telomeráza - telomery drozofily – Het-A, TART - centromery – CENP-B z DNA transposonů - imunitní systém – V(D)J rekombinace - syncytin v placentě (retrovirální env) Transpozony „přebudovávají“ genom - přestavby genomu, rekombinace - duplikace, rodiny, vznik nových genů (Setmar) - role v segregaci chromosomů, izolace, speciace - reparace zlomů v DNA - inaktivace chromosomu X - tvorba nových regulačních sítí Transpozony jsou extrémně důležitou evoluční silou! Francis Crick: Transpozony = Junk DNA, parazitic DNA, selfish DNA (1980) Susumu Ohno – evoluce genovou duplikací (1970) • Lidský genom obsahuje ~ 8000 retrokopií genů (Navarro, Galante, GBE, 2015) • Segmentální duplikace zodpovídají za více než 90 % genetické variability mezi lidskými populacemi (Sudmant et al., Science, 2015) Co bylo dříve – transpozony nebo epigenetické mechanizmy? Prokaryota: - malé genomy efektivně využité operony - malé množství transpozonů - primitivní epigenetické regulační mechanizmy určené k rozlišení vlastní od cizorodé DNA Eukaryota: - velké genomy plné repetic - obrovské počty transpozonů - složité epigenetické regulační mechanizmy Nekonvenční: Epigenetické mechanizmy umožnily množení transpozonů v genomech / a duplikace genů, čímž se zvýšil evoluční potenciál organizmů a mohly vzniknout složité mnohobuněčné životní formy. Nina Fedoroff, 2012, Science 338:758-767 vs. Konvenční výklad: Epigenetické mechanizmy se vyvinuly na obranu proti transpozonům. (Francis Crick – parazitické sekvence) Co bylo dříve – transpozony nebo epigenetické mechanizmy? • Mít transpozony je evoluční adaptace – transpozony čekají na svoji příležitost, aby zvýšily genetickou variabilitu svého hostitele v kritickém období • Všechny pohlavně se množící organismy, které se zbavily TE, nakonec vymřely (třídění z hlediska stability – J. Flegr, J. Toman) Ústav výzkumu globální změny AV ČR, Brno (CzechGlobe) Analýza transkriptomu řas – hledání genů zodpovědných za produkci omega-3 mastných kyselin pro potravinářství Mikrobiologický ústav AV ČR, Třeboň – CENTRUM ALGATECH Příprava transgenních a editovaných řas pomocí CRISPR/Cas9 pro produkci omega-3 mastných kyselin Chmelařský institut s.r.o., Žatec Co dělá dobrou IPA(u)? Metagenomika svrchně kvašených piv. Aplikovaný výzkum (spolupráce) Metody a přístrojové vybavení Metody molekulární biologie, genomika, práce s DNA a RNA pipety ependorfky enzymy DNA FACS Laserová mikrodisekce Příprava knihoven pro NGS (RNA-seq, smallRNA-seq, BS-seq) Bioinformatická analýza Jak získáváme biologický materiál – chromozomy, malé výřezy pletiv Využíváme moderních metod genomiky a bioinformatiky Sekvenace genomu, transkriptomu, metylomu… pomocí sekvenování nové generace (NGS) Bioinformatické analýzy velkých datových souborů (NGS i osekvenovaných genomů) Metody klasické genetiky Fylogenetické stromy Genetické mapy Tat Athila Y1 X Y1 Y1 Y1 Y2 Y2 Y2 Y2 X X X Jak vizualizujeme repetice/ geny v genomu Fluorescenční in situ hybridizace Provádíme také „single copy FISH“ s velmi krátkými sondami (několik kbp) = můžeme určit umístění genů na chromozomech Jak vytváříme transgenní rostliny Silenka je první transformovatelná rostlina s heteromorfními pohlavními chromozomy Umíme editovat genom = genové inženýrství, cílená mutageneze TALEN - mutageneze CRISPR/Cas9 - mutageneze University of Minnesota in Mineapolis Transgenerační přenos nových kopií TE ve wild type rostlinách/ mutantech v RdDM mOgre retrotranspozon Funkční studie University of Minnesota, USA University of Illinois, USA Penn State University, USA Universidad de Almería, Spain University of Lyon, France ETH, Switzerland IPK Gatersleben, Germany University of Helsinki, Finland University of Tokyo, Japan Zahraniční spolupráce Eduard Kejnovský Oddělení vývojové genetiky rostlin Biofyzikální ústav AV ČR kubat@ibp.cz hobza@ibp.cz