Laboratoř molekulární
patologie
Ústav patologie FN Brno
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
29.11.2018
Přehled činnosti
1. rutinní analýzy
2. výuka
3. výzkumná činnost
Rutinní analýzy
Přikrajování materiálu
foto: primář MUDr. Pavel Fabian, PhD., MOÚ
Příprava formol parafínových bloků
Příprava tkáňových řezů
Základní vyšetřovací metody v patologii:
morfologické vyšetření
barvení hematoxylinem a eosinem
Základní vyšetřovací metody v patologii:
morfologické vyšetření
Základní vyšetřovací metody v patologii:
morfologické vyšetření
Základní vyšetřovací metody v patologii:
imunohistochemická analýza
Základní vyšetřovací metody v patologii:
imunohistochemická analýza
Základní vyšetřovací metody v patologii:
imunohistochemická analýza
Místo molekulárně biologických metod v patologii:
Schéma diagnostického postupu
Místo molekulárně biologických metod v patologii:
Schéma diagnostického postupu
Markery
• diagnostické
• prognostické
• prediktivní
Některé rutinní analýzy
1. fluorescenční hybridizace in situ - FISH
2. určení klonality B- a T-receptorů
lymfocytů (PCR)
3. imunobloting
4. funkční analýza p53
1. Fluorescenční in situ hybridizace
(FISH)
Hybridizace
• tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a
komplementárních molekul nukleových kyselin
• založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA
Fluorescenční hybridizace in situ
FISH
Detekce DNA nebo RNA v intaktních
buňkách radioaktivními nebo
fluorescenčními sondami.
FISH 1: Detekce amplifikace genů
• Sonda specifická pro sledovaný gen a centromeru daného
chromozomu.
• Určuje se počet / poměr signálů sledovaného genu a signálů
odpovídajících počtu centromer = chromozomů.
• Např. amplifikace genu myc u neuroblastomů nebo genu c-erbB2
(HER2/neu) u nádorů prsu.
Analýza amplifikace genu HER2/neu
IHC
FISH
Analýza amplifikace genu HER2/neu
Analýza amplifikace (FISH) a
exprese genu HER2 (IHC)
FISH 2: Detekce translokace
chromozomů
• Pro detekci se použijí dvě sondy značené odlišnými fluorescenčními
barvami. Každá sonda se váže k sekvenci jednoho z genů.
• Pokud je přítomný fúzní gen, vznikne směsný signál v důsledku
fluorescence sond navázaných v těsném sousedství.
• Většinou je translokována pouze jedna alela, proto lze vedle
pozitivního signálu zachytit i samostatné signály obou sond.
Detekce translokace chromozomů
• translokace t(14;18) u folikulárního lymfomu (FL)
• translokace t(8;14) u Burkittova lymfomu (BL)
• přestavba genu c-myc u Burkittova lymfomu (BL)
• translokace t(11;14) u lymfomu z buněk plášťové zóny (MCL)
• přestavba genu MALT1 u MALT lymfomů
• přestavba genu ALK u karcinomů plic
• translokace ALK/EML4 u karcinomů plic
• … a mnoho dalších
Detekce translokace t(8;14)
negativní jádra
pozitivní jádra
c-myc/IGH
Detekce přestavby genu c-myc
 zlomová sonda
Detekce přestavby genu c-myc
negativní jádra
zlomová
sonda
Detekce přestavby genu c-myc
pozitivní jádra
zlomová
sonda
2. Určení klonality B- a T-receptorů
3. Imunobloting
Imunohistochemická analýza
• přítomnost a hladina proteinu
• lokalizace proteinu v buňce (jádro, cytoplasma, vazba na
membránu, …)
• počet/podíl pozitivních buněk
• výchozí materiál: formol-parafinový bloček
nádorový supresor p53 svalový protein dystrophin
Imunobloting
Imunohistochemická analýza
• přítomnost a hladina proteinu
• lokalizace proteinu v buňce (jádro, cytoplasma, vazba na
membránu, …)
• počet/podíl pozitivních buněk
• výchozí materiál: formol-parafinový bloček
Imunobloting
• detekce aberantních (např. zkrácených) forem proteinů
/hladiny proteinů
• výchozí materiál: čerstvě odebraná/zamražená tkáň
Porovnání IHC a IB
#38: 85% pozitivních jader #42: 30% pozitivních jader
Imunobloting
Imunobloting
• detekce aberantních (např. zkrácených) forem proteinů
/hladiny proteinů
• výchozí materiál: čerstvě odebraná/zamražená tkáň
• dystrofin
• calpain
KO 1 2 3
94
60
30
4. Analýza nádorového supresoru
p53: metodou FASAY
2. Zapojení do výuky - PřF
• kurs Molekulární biologie nádoru (2 hod/týdně; 1 semestr)
- určeno především studentům PGS oboru Buněčná a molekulární
biologie (PřF) a studentům 4. a 5. roč. magisterského studia
oboru Molekulární biologie a genetika (od 2001/2002)
- pro studenty PGS oborů Onkologie (od 2002/2003) a Lékařská
biologie (LF) (od 2006/2007)
• navazující Speciální seminář z biologie nádorů (1 hod/týdně; 1
semestr)
• kurs Biologie nádorů pro nebiology aneb buněčná filosofie (2
hod/týdně; 1 semestr)
- pro všechny studenty MU
Zapojení do výuky: LF
• přednáška „Molekulární podstata vývoje nádorů; Metody
molekulární patologie.“ v rámci kursu Patologie (Doc. Křen,
Prof. Hermanová)