Základy práce s aDNA – cvičení Protokol Barbora Miklasová 7. 1. 2018 Úvod V praktické části v rámci předmětu Základy práce s aDNA jsme provedli analýzu aDNA vybraného jedince z archeologických sbírek depozitáře LBMA. Cílem analýzy bylo jednak se prakticky seznámit s laboratorními metodami a dále určit haplotyp zkoumaného jedince podle analýzy HV1 regionu mtDNA. Mitochondriální DNA (mtDNA) je kruhová dvouřetězcová molekula DNA, obsažená ve 2-8 kopiích v mitochondriích eukaryotických buněk. Je nositelkou mimojaderné genetické informace. Dědičnost mtDNA u lidí (u savců) probíhá uniparentálně, konkrétně matrilineárně. Na molekule mtDNA rozlišujeme těžký řetězec, bohatý na purinové báze, a lehký, v němž převažují pyrimidinové báze. Délka lidské mtDNA je 16 569 párů bází. Na molekule mtDNA byla identifikována kódující oblast 13 genů pro tvorbu polypeptidů, které zajišťují metabolismus mitochondrií, dále 2 genů pro rRNA a 22 genů pro tRNA. Na molekule rozlišujeme i kontrolní oblast, tzv. D-smyčku, dlouhou 1 124 párů bází, v níž se nachází počátek replikace těžkého řetězce a je oblastí nasedání transkripčních faktorů. V této oblasti byl zjištěn několikanásobně vyšší výskyt jedonukleotidových polymorfismů (SNP), konkrétně na místech tzv. hypervariabilních oblastí HV1, HV2 a HV3. Při studiu kombinací SNP v hypervariabilních oblastech lze porovnáním mtDNA jedince s rCRS (revidovaná Cambridžská referenční sekvence) stanovit tzv. haplotyp. Jednotlivé haplotypy pak řadíme do haploskupin, díky kterým můžeme sledovat příbuznost po mateřské linii zpětně, a tak zkoumat genetický vývoj populací ve světě a odhadovat jejich migrace v historii, neboli sestavit fylogenetické stromy lidských populací. Materiál Pro analýzu aDNA byly použity vzorky kostní tkáně a zubu jedince z hrobu č. 727 z archeologického naleziště Znojmo Hradiště, patřící k osídlení velkomoravské populace, tedy z období přelomu 9./10. stol. n.l. Antropologický materiál byl na lokalitě vyzvednut v roce 2012. Odhad stáří – dospělý jedinec, datum odběru 6. 10. 2017, označení vzorku ZH 727 A. · KOST – vzorek 1x1cm z místa přechodu proximální epifýzy a diafýzy levého femuru, bez povrchového poškození v místě odběru, zachovalost kosti středně dobrá s poškozenou kloubní hlavicí a chybějící částí proxim. epifýzy. · ZUB – trvalý zub, horní levá 3 stolička (/M3), zub bez poškození se zachovalými kořeny. Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:DSCF5326_m_kost.jpg Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:DSCF5323_m_zub.jpg Metody Analýza HV1 regionu mitochondriální aDNA zahrnovala přípravu vzorků, izolaci za použití izolačního protokolu PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction kit, dále PCR amplifikaci, vizualizaci PCR produktů gelovou elektroforézou, purifikaci PCR produktů a sekvenaci produktů pomocí laboratoří spol. Seqme, s.r.o. Při všech krocích bylo potřeba dodržovat protikontaminační opatření LBMA. · Příprava vzorků Z kosti byl vyřezán vzorek 1x1cm bruskou, zub byl použit celý a jeho povrch byl jemně mechanicky obroušen pro odstranění nečistot. Vzorky byly otřeny DNA free vodou, DNA removerem a exponovány UV záření po dobu 20 minut z každé strany pro odstranění povrchové DNA. Poté byly namlety na prášek a přesypány do zkumavek, každý zvlášť. · Izolace aDNA Nejprve jsme připravily lyzační pufr: Komponenta Objem (1 reakce) PrepFiler® BTA Lysis Buffer 220 μl 1.0 M DTT 3 μl Proteináza K 7 μl Po přidání ke vzorku jsme směs důkladně promíchaly a nechaly inkubovat při 56°C po dobu 24 hodin. Poté byly vzorky centrifugovány, lyzát bez sedimentu odebrán a uchován v lednici po dobu 2 týdnů. Po přidání PrepFiler Lysis Bufferu byly ke vzorkům napipetovány magnetické částice PrepFiler Magnetic Particles a pomalu a krátce promíchány, stejně tak izopropanol. Dále byly směsi 10 minut inkubovány při pokojové teplotě a zvortexovány na maximum. Následně byly zkumavky umístěny do magnetického stojanu na 10 minut pro nasednutí mag. částic s navázanou DNA na stranu. Poté mohla být odsáta vodná fáze. Vzorky byly promývány Prepfiler Wash Bufferem A a B a při opakovaném umísťování do magnetického pole byla odsáta veškerá tekutina. Poté jsme přidaly Prepfiler Elution Buffer, směsi promíchaly a inkubovaly, aby se molekuly DNA opět vyvázaly z magnetických částic. Po umístění zkumavek do magnetického stojánku pak bylo možné pipetou odsát čistý izolát s aDNA. · PCR amplifikace Jelikož aDNA je ve většině případů poškozená a degradovaná, místo klasické Taq polymerázy jsme použily mtDNA restorázu, která je schopná v různé míře aDNA opravit. Proto samotné PCR amplifikaci předcházela inkubace vzorků s reakční směsí s mtDNA restorázou po dobu 1 hodiny. Až poté byly ke směsi přidány primery a spuštěna PCR. Vzhledem k rozdělení vzorků, viz níže, byla reakční směs, neboli tzv. mastermix, připravena o následujícím objemu (násobek 11): Reagencie Objem Množství Upravený objem 10x Restorase reaction buffer 5 1x 55 dNTPs Mix 8 200 µM/každý 88 Primer forward 1 0,5 µM 11 Primer reverse 1 0,5 µM 11 DDW 24 264 Restorase 1 0,05U/µL 11 DNA 10 1-2 ng 110 Celkem 50 550 Pro zvýšení přesnosti analýzy byly amplifikovány 4 překrývající se úseky sekvence v regionu HV1 (označeny HVI/1, HVI/2, HVI/3, HVI/4). K tomu bylo zapotřebí zvolit 4 vhodné dvojice primerů, přímý (forward), ohraničující začátek sekvence, a zpětný (reverse), definující konec. Z toho důvodu byl vzorek kostní tkáně a stejně tak i vzorek ze zubu rozpipetován, každý do 4 jamek kolonky. Pro kontrolu úspěšné PCR a případné kontaminace byla zařazena i pozitivní (s již známou DNA) a negativní (čistá voda) kontrola. Celkem tedy 10 jamek. Sekvence zvolených primerů a délku amplifikovaných úseků uvádí následující tabulka: Mt DNA region Sequence of primers Product size HV1 F15989 HV I/1 1a CCCAAAGCTAAGATTCTAAT 165 bp R16153* 1b CAGGTGGTCAAGTATTTATGG F16097* HV I/2 2a TACATTACTGCCAGCCAC 137 bp R16233* 2b TGATAGTTGAAGGTTGATTGCTGT F16159 * HV I/3 3a CATAAAAACCCAATCCACAT 146 bp R16304 3b ACTGTTAAGGGTGGGTAGGT F16247* HV I/4 4a ACTCCAAAGCCACCCCTCA 164 bp R16410 4b GAGGATGGTGGTCAAGGGAC Průběh PCR je popsán tabulkou: Preinkubace 37 °C 1 hod 72 °C 5 min Iniciační denaturace 94 °C 30 sec Přidání primerů 35 °C v termobloku Denaturace 94 °C 30 sec Annealing 56 °C 30 sec 40x Extenze 72°C 30 sec Finální extenze 72 °C 7 min · Vizualizace gelovou elektroforézou Pro elektroforézu jsme použily 3% agarózový gel, který jsme připravily z 2,1 g agarózy a 80 ml TBE pufru. Pro možnost vizualizace jsme do gelu přidaly 16 µl Nancy – 520 DNA Gel stain solution (Sigma Aldrich) a zároveň jsme k PCR produktům přidaly 5 µl gelové barvičku Gel Loading Solution (Sigma Aldrich). Do připravených jamek jsme napipetovaly 10 µl alelického žebříku a dále po 10 µl PCR produktu z každé jamky. Po zapojení elektrod jsme reakci nechaly běžet cca 1 hodinu. · Sekvenace Před samotným sekvenováním jsme směsi naamplifikovaných PCR produktů nejprve přečistily od přítomných primerů a dNTP, a to inkubací 10 µl každého vzorku se 4 µl CleanSweep PCR Purification Regagentem a následnou deaktivací enzymu zvýšením teploty až na 80 °C. Následně jsme přečištěné PCR produkty obohatily opět sekvenačními primery v potřebném množství. Pro sekvenaci byly vzorky zaslány do společnosti Seqme, s.r.o. Výsledky Výsledkem vizualizace gelovou elektroforézou je následující elektrofoterogram: Textové pole: 1 – HVI/1 kost 2 – HVI/2 kost 3 – HVI/3 kost 4 – HVI/4 kost 5 – HVI/1 zub 6 – HVI/2 zub 7 – HVI/3 zub 8 – HVI/4 zub 9 – negativní kontrola 10 – pozitivní kontrola Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:ELFO výsledky 2:ELFO výsledky:Slide1.png Na něm vidíme, že PCR amplifikace byla úspěšná pouze u vzorků ze zubu, a to konkrétně u vzorků 6, 7, 8, kde máme produkty regionů HVI/2, HVI/3 a HVI/4. Negativní kontrola značí nepřítomnost kontaminace cizorodou DNA a pozitivní kontrola je potvrzením úspěšně proběhlé PCR. Výsledkem Sangerova sekvenování ukazují následující obrázky: HVI/1 forward Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:1 seq.jpg HVI/1 reverse Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:2 seq.jpg HVI/2 forward Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:3 seq.jpg HVI/2 reverse Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:4 seq.jpg HVI/3 forward Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:5 seq.jpg HVI/3 reverse Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:6 seq.jpg HVI/4 forward Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:7 seq.jpg HVI/4 reverse Macintosh HD:Users:smicik:Documents:BRNO MU:Předměty:aDNA:8 seq.jpg Výsledné sekvence: HVI/1 165 bp 1. forward – neúspěšná sekvenace/amplifikace 2. z reverzího řetězce – nenalezen žádný z primerů MTTCTCAGAGSCYGGAAAAGGGGCGRAACCMGCTCTAWCWTCAGGGGGAAGRCGCTATGGYAAAGACCATARCATWACTGAYCSGTCAACAAYMGSTAC TATAACTACATCTGGATCGGCCACCCTGAGAGGT HVI/2 137bp 3. forward - modře 3a primer TACTAATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCCCCTCCCCATGCTWACAAGCAAGTACAGCAATCAACCTTCAACTATC AAA 4. z reverzního – zeleně 2a + modře 3a + žlutě 1b rev. primery TTTTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATAAATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCCCCTCCT YATGCA HVI/3 146 bp 5. forward – fialově 4a primer GKCAATCACAMCYWCAACTATCACACATCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCAYTAGGATACCAACAAACCWACCCACCCTTAACAGTGATG 6. z reverzního – 2b primer TCGCATAWAAACCCAATCCACATCAAAACCCCCTCCCCATGCTTACARGCAAGTACAGCAATCAACCCTCAACTATCACACATCAACTGYAACWMCAG HVI/4 164 bp 7. forward – nenalezen primer AGYACATASYACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGAC CACCATCCTCCA 8. z reverzního – 4a primer TACTCCAAAGCCACCCCTCACCCAYTAGGATACCAACAAACCTACCCAYCYTTAACAGTACRTAGTACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTAC AGTSAAATCCYTCTMGACG Souvislá sekvence proti rCRS: CCCAAAGCTAAGATTCTAATTTAAACTATTCTCTGTTCTTTCATGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACAACCGCTA TGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATAAATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCC CCTCCTYATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCTTCAACTATCACACATCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCAYTAGGATACCAACAAA CCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCCTCAG ATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCT šedě nezískaná sekvence, barevně primery, červeně tučně rozdíly v sekvenci Při porovnání v programu MITOMASTER https://www.mitomap.org/foswiki/bin/view/MITOMASTER/WebHome) byla určena haploskupina X2b (X2b + 226 + 16192) se 2 variantami: C16192T a C16223T. Závěr Analýza mtDNA příslušníka velkomoravské populace z hrobu ZH 727 byla provedena ze 2 tkáňových vzorků, z kosti a ze zubu. Amplifikace PCR se ukázala jako úspěšná pouze ze zubu, u všech 4 vzorků z kosti byl výtěžek nedostačují. Příčinou mohlo být poškození proximální epifýzy femuru, kudy se dovnitř kosti mohla dostat voda a jiné faktory, degradující DNA po smrti jedince. Jako úspěch bych hodnotila fakt, že nebyla prokázána kontaminace cizorodou DNA a zároveň bylo možné eliminovat inhibitory analýz, takže výtěžek ze zubu vedl úspěšně k určení haplotypu jedince podle mtDNA. Na základě srovnání sekvence HV1 obasti s referenční Cambridžkou sekvencí byl jedinec zařazen do haploskupiny X2B 2 variantami SNP, a to C16192T a C16223T. Haploskupina X2b patří do linie velké výchozí skupiny N, ze které se oddělila před 20 000 – 30 000 lety. Haploskupina X2b, je jednou z podskupin haploskupiny X, což je jedna z nejméně zastoupených maternálních haploskupin v současné Evropě (1%). Pozorována je především v Řecku, Makedonii, Rumunsku a v okolí Kavkazu. Jediné Euroasijské etnikum, které má poměrně vysoký podíl haploskupiny X (15%) jsou Drúzové žijící v Libanonu, Sýrii a Izraeli. X2b se nejčastěji objevuje v neolitické Evropě. Skupina byla identifikována vnálezech po celé Evropě, i na Sardinii,nebo v Maroku. Také se vyskytuje v populacích původních obyvatel Amerického kontinentu. Předpokládá se tedy, že nositelé tohoto haplotypu byly účastni v první vlně při osidlování Ameriky. Podle výzkumů populací v jižních oblastech Sibiře došlo k rozšíření této haploskupiny do Asie teprve nedávno, zhruba v 5. stol. př. n.l., pravděpodobně z oblasti Jižního Kavkazu. Nabízí se tedy otázka, zda náš jedinec, příslušník velkomoravské populace, mohl získat tyto varianty jakožto příslušník slovanské populace, jejichž původ se odhaduje do oblasti Zakarpatí, nebo zda mohly být tyto alelové varianty např. více zastoupeny u populací zemědělců, ke kterým Slované na našem území patřily. Pro lepší porozumění by bylo potřeba zjistit četnost haploskupiny v rámci velkomoravské populace a porovnat ji s četností např. s dřívějšími populacemi, obývající toto území.