1 Kvasinky • Zařazení do systému • Eukaryotní mikroorganizmy • Heterotrofní, většinou jednobuněčné, aerobní nebo fakultativně anaerobní • Velikost buňky 3 – 15 µm, rotační elipsoid až vláknitý tvar • Patří mezi houby (Fungi) vegetativní rozmnožování - pučení a dělení podle pohlavního rozmnožování je dělíme na: Askomycety Bazidiomycety • Známo je asi 700 druhů kvasinek 2 Tvar buňky kvasinek a - sférický b - elipsoidní c - citronkový d - ogivální e - lahvovitý f - podlouhlý g - vláknitý Buňka kvasinek 1. Buněčná stěna 2. Zárodečná jizva 3. Cytoplazmatická membrána 4. Jádro 5. Jaderná membrána 6. Vakuola 7. Endoplazmatické retikulum 8. Mitochondrie 9. Glykogen 10. Polymetafosfát (volutin) 11. Lipid 12. Golgiho aparát 3 Buňka kvasinek – chemické složení • Voda 65 – 80 % • Dusíkaté látky 45 – 60 % • Cukry 15 – 37 % • Lipidy 2 – 12 % • Minerální látky 6 – 12 % (P2O5, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn) • Růstové látky, vitamíny skupiny B, vitamín C atd. • Charakteristické bílkoviny kvasinek: cerevizin (typický kvasinkový albumin), zymokasein (fosfoprotein) a glutatiol Buňka kvasinek – chemické složení • Sacharidy – sacharidy buněčné stěny (glukan a manan) + sacharidy cytoplazmy (glykogen a manan) • Nukleové kyseliny – jsou obsaženy v jádru a mitochondriích • Lipidy – převaha vázaných tuků v buněčných strukturách nebo tuky volné v cytoplazmě ve formě kapének • Složené tuky (fosfolipidy a glykolipidy): Fosfolipid lecitin a kefalin – uplatnění pro metabolizmu tuků Lecitin reguluje propustnost BS 4 Buňka kvasinek 1 - buněčná stěna 2 - cytoplazmatická membrána 3 - jádro 4 - vakuola 5 - mitochondrie 6 - endoplazmatické retikulum 4 6 5 1 2 3 Buněčná stěna • Síla 25 nm, 25 % sušiny buňky • Základní složky: glukan, manan, protein, lipid, chitin, fosfát • Polysacharidy (80 % sušiny stěny) - struktura vláken tvořících hustou síť • Bílkoviny strukturní (6 – 10 % sušiny stěny) - tvoří výplň sítě, převaha aminokyselin kys. asparagová a glutamová • Bílkoviny s enzymatickou aktivitou – invertáza, kyselá fosfatáza, lipáza, glukonáza, manáza • Lipidy a fosfolipidy (do 5 % sušiny stěny) - výskyt nepravidelný • Fosforečnany - diesterové vazby mezi polysacharidy • Chitin – polymer N-acetyl-D-glukozaminu, výskyt v místě jizev 5 Struktura buněčné stěny kvasinek Detailní struktura není dosud známa. 3 vrstvy: glukan, manan, mezi nimi matrix tvořená komplexy manan-protein vázané mezi sebou disulfidickými můstky Buněčná stěna - jizvy Jizva po pučení Jizva po pučení Zárodečná jizva ◄ Lom stěny po zmrazení Jizvy – glukozamin, chitin Počet jizev mezi 23 a 43 na buňku, v místě jizev není aktivní povrch, u starších buněk je proto omezena metabolická aktivita 6 Kvasinkový pupen a jizva po pučení Obrázek: ESM (electron scan microscopy) Buněčná stěna - protoplasty Protoplast → Helix pomatia - snail enzym „šnekáza“ (helikáza) Protoplasty – využití u nesporulujících kvasinek pro křížení – fúze protoplastů. Je možná reverze na nativní buňku (polyetylenglykol + ionty vápníku) Pokud není buněčná stěna zcela odstraněna, vznikají sféroplasty, je možná regenerace 7 Buňka kvasinek 1 - buněčná stěna 2 - cytoplazmatická membrána 3 - jádro 4 - vakuola 5 - mitochondrie 6 - endoplazmatické retikulum 4 6 5 1 2 3 Cytoplazmatická membrána • Plazmalema, plazmatická membrána • Klasická dvojvrstevná membrána • Tloušťka 7,5 - 8 nm, mozaiková struktura • Není sídlem enzymů oxidativní fosforylace (sídlem oxidoredukčních enzymů je vnitřní membrána mitochondrie) • Velmi časté invaginace tvaru měchýřků a tubul • Funkce CM: 1. Tvoří elastický obal a bariéru na povrchu buňky 2. Zodpovědná za transport látek (aktivní, pasivní, zprostředkovaná difúze) a osmoregulaci 3. Je místem syntézy některých komponent buněčné stěny a “obalových polysacharidů“ 8 Jádro • Dvojitá jaderná membrána (karyolema) s velkými póry, mezi vrstvami membrány je tzv. perinukleární prostor, diferenciace polárního tělíska • Umístěno přibližně ve středu buňky • Počet chromozomů 16 (u S.cerevisiae) • V karyoplazmě diploidních buněk je také kruhová DNA ► Jadérko (nukleolus) + karyoplazma V nukleoplazmě jsou plazmidy: plazmid 2μm – počet kopií 60 až 100 4-vakuola 2-cytoplazmatická membrána 1-buněčná stěna 5-mitochondrie 6-endoplazmatické retikulum 4 6 5 1 2 3-jádro 3 Jádro – chromatin • Skládá se z nukleozomálních histonů H2A , H2B – podobné některé úseky s jinými eukaryoty H3 – u kvasinek je odlišný H4 – podobný jako u vyšších eukaryot Tento tetramerní útvar tvoří dřeň jádra, je obalen DNA, tvoří nukleozom Dělení jádra – při vegetativním množení – mitózou, při pohlavním množení (vzniku pohlavních spor) meiózou – výsledek: 4 haploidní jádra (4 haploidní spory) 9 Vakuola • Nejnápadnější složka buňky, až 90 % prostoru • Sférický útvar obdaný jednoduchou membránou (tonoplastem) • Často vysílá výběžky do cytoplazmy • U starších buněk obvykle jedna velká vakuola (může vyplňovat většinu prostoru) • Rozpad vakuoly před a fúze po dělení buňky 4-vakuola 2-cytoplazmatická membrána 1-buněčná stěna 5-mitochondrie 6-endoplazmatické retikulum 4 6 5 1 2 3-jádro 3 Vakuola • Obsahuje hydrolytické enzymy (proteinázy, esterázy, ribonukleázu) • Má tedy podobnou funkci jako lyzozomy vyšších eukaryot • Obsahuje polyfosfáty (volutin), velkou zásobu volných aminokyselin, purinů, bílkoviny a tuky • Ve formě krystalků zde může být také hromaděna kyselina močová a izoguanin • Podíl na udržování intracelulárního pH 10 Mitochondrie • Jsou různého tvaru (kulovité, válcovité, laločnaté, ..) • Velikost ►šířka 0,3 - 1,0 μm, délka 1 - 3 μm • 2 membrány – vnitřní a vnější - vnější část vnitřní m. – enzymy glykolýzy - vnitřní část vnitřní m. – enzymy Krebsova cyklu, ATPáza • Obsahují vlastní, mitochondriální, DNA (cirkulární) – mtDNA • Dělení je nezávislé na dělení buňky • Mitochondriální ribozomy (mitoribozomy) – mt-ribozomy 76S – sedimentační konstanta • Počet závisí na metabolické aktivitě 4-vakuola 2-cytoplazmatická membrána 1-buněčná stěna 5-mitochondrie 6-endoplazmatické retikulum 4 6 5 1 2 3-jádro 3 Mitochondrie • Respiračně deficientní mutanti Při potlačení respirace nebo po mutaci Zdrojem energie zůstává pouze fermentace Malé kolonie, tzv. petit kolonie • Promitochondrie Mitochondrie změněné vlivem vnějšího prostředí Morfologicky jednodušší, omezená metabolická aktivita Reverzibilní stav – po odeznění faktoru, který změnu vyvolal, nastane plný návrat do původního stavu 11 Mitochondrie Mitochondrie vnější membrána prostor mezi vnější a vnitřní membránou vnitřní membrána, kristy ATPáza matrix intramitochondriální inkluze mitoribozomy mtDNA • Mezimembránový prostor: mezi vnější a vnitřní membránou, vyplněn matrix • Mezikristový prostor 12 Endoplazmatické retikulum • Vytváří cisterny, lamely, tubuly, .. • Skládá se ze dvou membrán (vnější a vnitřní) • Mezi nimi echylema, ve které jsou globulární tělíska • Obvykle je spojeno s plazmalemou nebo s jadernou membránou • Obě membrány jsou asymetrické • Na vnější membránu jsou vázány ribozomy • Hladké a drsné ER s ribozomy • Proteiny – posttranslační úpravy a transport na místo určení sekrečními membránovými měchýřky 4-vakuola 2-cytoplazmatická membrána 1-buněčná stěna 5-mitochondrie 6-endoplazmatické retikulum 4 6 5 1 2 3-jádro 3 Podobné ER vyšších rostlin a živočichů Je místem syntézy proteinů Endoplazmatické retikulum drsné 13 Golgiho komplex • U kvasinek může a nemusí být přítomen (jeho funkci může převzít ER) • Obvykle je tvořen jedním nebo více diktyozomy • U kvasinek existuje Golgiho aparát jen ve formě jednotlivých diktyozomů – cisteren, z jejichž obou konců se uvolňují měchýřky • Počet diktyozomů je závislý na aktivitě buňky • Předpokládá se úzký vztah s dělením buňky • Funkčně navazuje na endoplazmatické retikulum, upravuje jeho produkty, zajišťuje jejich transport Popsán pouze u eukaryot Cytoskelet • Je to síť proteinových vláken • Jsou přítomné v základní cytoplazmě i v jádře • Umožňuje vnitrobuněčný pohyb organel • Přítomnost mikrotubulů ► málo ohebné trubice složené z bílkovinných podjednotek ►tubulin, přítomen je také aktin • Každá molekula tubulinu obsahuje guanozintrifosfát • Mikrotubuly vycházejí z určitého centra a konce jsou rozkládány nebo obnovovány podle potřeby 14 Cytoskelet - mikrotubuly • Mikrotubuly uskutečňují pohyb organel prostřednictvím tzv. mechanoenzymů, např. myozinů • Pohyb se děje za spotřeby ATP • Myoziny – jsou zodpovědné za tvorbu primárního septa, pohyb jádra, mitochondrií, ….. • Kineziny a dyneiny se uplatňují při fúzi jader a při dělení jader • Kineziny umožňují pohyb od mikrotubulárních center, dyneiny k centrům Cytosol (cytoplazma) • Protoplast po odstranění buněčných organel ►cytosol, cytoplazma • Koloidní stav – přítomnost bílkovin, glykogenu a jiných rozpuštěných makromolekulárních a nízkomolekulárních látek • pH 6,2 – 6,4 • Diferenciační centrifugací se získají mikrotělíska - mikrozomy - peroxizomy - glyoxizomy 15 Ribozomy • Sférické organely o velikosti 20 – 30 nm • Sedimentační koeficient 70 – 80S • 80S může disociovat na 40S a 60S podjednotky • 60S - 5S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA + 40 různých bílkovin) • 40S – 18S rRNA + 30 různých bílkovin • Ribozomy mohou být volné nebo vázané na ER • Počet v závislosti na fyziologickém stavu buňky, složení vnějšího prostředí a rychlosti růstu Rozmnožování kvasinek • Vegetativní - pučení - příčné dělení • Pohlavní – spájení: - izogamní - heterogamní 16 Pučení • multilaterální (Saccharomyces cerevisiae) • bipolární Schéma pučící buňky 1. Jádro (mitóza) 2. Mitochondrie 3. Vakuola 4. Endoplazmatické retikulum 5. Pólové tělísko vřeténka 6. Mikrotubuly 7. Vřeténko Pučení Proces trvá cca 2 h 17 Pučení Řez pučící buňkou Rhodotorula glutinis 1.Vakuola 2.Cytoplazmatická membrána 3.Cytoplazma 4.Lom stěny 5.Jizva po předchozím pučení 6.Jádro 7.Mitochondrie 8.Endoplazmatické retikulum Póry v jaderné membráně ▼ ▼ 1 2 1 6 7 77 7 7 7 7 8 8 4 3 5 Pučení - bipolární Zárodečná jizva 1 3 ► ► ◄ 1 - primordium 2 – mateřská jizva 3 – zárodečná jizva 1, 2 Mateřská buňka ▼ Pupen ▼ 18 Pučení - bipolární tvorba nového pupene Pučení - bipolární • U některých druhů s protáhlými buňkami se pupeny neoddělují a vytváří se tzv. pseudomycelium (bez centrálního póru) • V určitých místech pseudomycelia vznikají svazky kratších elipsoidních buněk - blastospory • Např. Aureobasidium pullulans 19 Vegetativní spory • Blastokonidie Na stranách nebo na konci hyf Elipsoidní, okrouhlé nebo protáhlé • Artrokonidie Vznik rozpadem hyf, válečkovité Např. Trichosporon, Endomyces, Geotrichum • Chlamydospory Vznik na koncích hyf, interkalárně nebo volně v prostředí Velké silnostěnné buňky, obsah zásobních látek – bílkovin a lipidů, také pigmentů Vznik za nepříznivých podmínek prostředí Např. Candida albicans, Aureobasidium pullulans, Candida pulcherina Rozmnožování kvasinek • Vegetativní - pučení - příčné dělení • Pohlavní – spájení: - izogamní - heterogamní 20 Příčné dělení zřídka - např. rod Schizosaccharomyces Příčné dělení 1 (po dělení jsou buňky jednotlivé) Příčné dělení 2 (vede ke vzniku mycelia nebo pseudomycelia) Příčné dělení – tvorba mycelia ▲ ▼ ●● ● ▲ ▼ Mycelium Pseudomycelium ● centrální pór ▲ - tvorba přepážky (septa) 21 Rozmnožování kvasinek • Vegetativní - pučení - přehrádečné dělení • Pohlavní – spájení: - izogamní - heterogamní Rozmnožování kvasinek - pohlavní • Pohlavní endospory (askospory) • Pohlavní exospory (sporidie) – jen u dvou rodů • Proces pohlavního rozmnožování: Spájení dvou n buněk a jader – vznik 2n zygoty Redukční dělení 2n jádra meiózou – 4n jádra – 4n pohlavní spory 22 Rozmnožování kvasinek - pohlavní • Izogamní spájení – spájení dvou stejně velkých buněk, např. rod Saccharomyces • Heterogamní spájení – spájení dvou nestejně velkých buněk nebo mateřské buňky s pupenem (Debaromyces) • Homotalické kmeny – kmen má buňky jednoho párovacího typu α nebo a • Heterotalické kmeny – kmen má buňky opačného párovacího typu α i a (+ , - ; h+, h-) – většina kvasinek V přítomnosti buněk α i a fúzí vzniká zygota α/a Specifický feromon řídí celý proces, naruší BS pro aglutinaci buněk obou párovacích typů. Rozmnožování kvasinek - pohlavní • Párovací typ kvasinek je dědičný a je determinován geny MAT (mat α pro buňky typu α, nebo mat a pro buňky typu a) • Lokus MAT je lokalizován na chromozomu III • Lokus MAT kontroluje také proces sporulace • Lokus MAT je zodpovědný za produkci specifického peptidu – “feromonu“ • Lokus MAT je velmi stabilní. Měnit s může jen mutací a→α , nebo α→a 23 Rozmnožování kvasinek - pohlavní • Funkce “feromonu“ - zastavuje buněčný cyklus v uzlovém kontrolním bodě fáze G1 - mění náboj povrchu buněk opačného párovacího typu (možnost aglutinace) - “změkčuje“ stěny buněk opačného párovacího typu – buňky mění tvar Rozmnožování kvasinek - pohlavní Izogamní spájení a – změna tvaru buňky b – vznik zygoty c – pučení zygoty 24 Rozmnožování kvasinek - pohlavní Izogamní spájení 1 - zygota 1 1 Rozmnožování kvasinek - pohlavní a – diploidní jádro b – rozdělení pólového tělíska c – vytvoření vřeténka d – rozpad vřeténka e – rozdělení obou pólových tělísek f – vytvoření dvou vřetének g – rozpad vřetének a vytvoření čtyř haploidních jader 1 – pólové tělísko, 2 – mikrotubuly, 3 – vřeténko, 4 – jadérko, 5 – kulovité tělísko, 6 – polykomplexní tělísko Jednotlivé fáze meiózy u Saccharomyces cerevisiae 25 Rozmnožování kvasinek - pohlavní α x a → dikaryot zygota → → 4 haploidní spory askus Saccharomyces cerevisiae spóra ▼ Pokud při meióze dojde k nepravidelnosti nebo některé z jader zanikne, je počet spor v asku menší Celá buňka se mění ve vřecko Rozmnožování kvasinek - pohlavní Tvar askospor u kvasinek a – ledvinovitý (Kluyveromyces marxianus ar. marxianus) b – kloboukovitý (Hansenula anomala) c – saturnovitý (H. saturnus) d – vřetenovitý (Nematospora coryli) e – jehlovitý (Metschnikowia plucherrima) f – tvaru čepice (Wickerhamia fluorescens) 26 Heterogamní spájení a tvorba asků Rozmnožování kvasinek - pohlavní a – Debaryomyces b – Nadsonia 1 – askus 2 – askospory 3 – tuk Ke spájení může dojít i mezi mateřskou buňkou a pupenem Životní cyklus kvasinek • Střídání haploidní a diploidní fáze Vegetativní množení Vegetativní množení ↓ ↓ 27 Životní cyklus Saccharomyces cerevisiae Kmeny homotalické i heterotalické Nejčastěji se vyskytují v diploidní fázi Životní cyklus Schizosaccharomyces pombe Vm Vm Vm + - Dc As Sp + + + - -- Dc – diploidní buňka (jen zygota!!) Vm – vegetativní množení As - askus Sp - spory → haploidní fáze → diploidní fáze H H – haploidní buňkaRozmnožuje se příčným dělením (nepučí) Askus s 1 – 8 askosporami Pohlavní množení: izogamní konjugace Podobná velikost genetické informace jako S. cerevisiae, ale jen 3 chromozomy, v genech časté introny Nejčastěji se vyskytují v haploidní fázi 28 Životní cyklus Torulopsis sp. Vm H H – haploidní buňka Vm – vegetativní množení → výhradně haploidní fáze Např. Torulopsis, Candida, Rhodotorula aj. Životní cyklus Saccharomyces ludvigii As CSp D As - askus D - dikaryot CSp – spájení spory Ke spájení askospor dochází přímo ve vřecku Haploidní fáze neexistuje vůbec!!! Spájení askospor 29 Životní cyklus u rodu Leucosporidium Vytváří pohlavní exospory - sporidie Pučením sporidie vzniká haploidní vegetativní buňka Životní cyklus rodu Filobasidiella teleomorfa kvasinky Cryptococcus Vytváří pohlavní exospory - bazidiospory 1 ▲ 1 na polokulovitém konci bazidie vzniká 8 přisedlých bazidiospor 30 Využití kvasinek Pivovarské kmeny kvasinek: Kmeny spodního kvašení: kvašení probíhá při teplotách pod 10°C, po dobu asi 7 dnů, etanoltolerance nemusí být vysoká, po skončeném kvašení kvasinky sedimentují Kmeny svrchního kvašení: kvašení probíhá kratší dobu při teplotách 20°C a kvasinky jsou na konci vynášeny na povrch tekutiny Využití kvasinek Vinařské kmeny kvasinek Je požadována střední etanoltolerance, kvašení probíhá při 25°C po dobu 7-14 dnů (obsah etanolu při porovnání s lihovarskou výrobou roste pomalu). Je požadována i odolnost k SO2, kterým se ošetřuje vinný mošt, po skončení kvašení je žádoucí autolýza kvasinek, neboť přispívá k vytváření buketu vína. U kmenů pro výrobu šampaňských vín je nutná odolnost až k 8 – 12 % etanolu od počátku kvašení. U kmenů pro výrobu tokajských vín je nutná odolnost ke zvýšenému osmotickému tlaku. 31 Využití kvasinek Lihovarské kmeny kvasinek Požadována je vysoká odolnost k etanolu, neboť kvašení probíhá pouze po dobu 24 – 48 h, během nichž obsah etanolu roste rychle až k 11 % (vysoká rychlost fermentace) Vhodná je i osmotolerance, která umožňuje využití koncentrovanějších melas. Kvasinky na rozdíl od pivovarských nemají schopnost aglutinovat a sedimentovat Využití kvasinek Pekařské kmeny Cílem je získání co největší biomasy, požaduje se proto rychlé množení a co nejmenší sklon k alkoholovému kvašení, protože zdroj C a energie má být maximálně využit k tvorbě biomasy. Kultivace probíhá za aerobních podmínek a uplatňuje se hlavně respirace. Kvasinky nesmí aglutinovat, mají minimálně adsorbovat barviva (vzhled kvasinek a nemají mít sklon k autolýze (trvanlivost droždí)