Mikroskopické techniky „The role of the infinitely small in nature is infinitely large" Louis Pasteur "Objekt, který má reálně 1 milimetr, by měl při zvětšení tímto mikroskopem 700 metrů," Ústav molekulární genetiky AV ČR elektronový mikroskop Tecnai T20 Vývoj buněčné teorie rOZVOJ mikroskopie (l7. století až současnost) I Jan Evangelista Purkyně (1787-1869) mezi prvními na | světě přisoudil buňkám jejich stěžejní význam pro život j.E.pijrkyně MatthiasJ. Schleiden (1804-81) a Theodor Schwann (isio-82 1839 buněčná teorie: Vývoj živé přírody se opírá o růst a tvoření buněk, buňky rostlin a živočichů se shodují tvarem a funkcí. Buňka je základní, stavební a funkční jednotkou živých organismů. Rudolf Virchow (1821-1902) „nové buňky vznikají jen dělením z již existujících" L. Pasteur (1822-85) fermentace, popřel teorii spontánního tvoření buněk' Louis >asteur R.Virchow rOZVOJ biochemie l.pol.20.stol 1953 struktura DNA (Watson, Crick,Franklinová) 9 Broth is Boiled Broth Remains Free of Microorganisms Curved Neck is Removed o Microorganisms Grow in Broth https://amoebamike.wordpress.com Coccus 3 Neisseriae {coffee-bean (cocci in pairs) shape in pairs) Diplococci Tetrads (cocci in packets of 4) Streptococci (cocci in chains Rod. or Bacillus / W cJ Coccobaeilli Sarcinae (cocci in packets of 8,16.32 cells) Micrococci and staphylococci (large cocci in irregular clusters) Spore-forming rods Corynebacteria (palisades arrangement) Streptomycetes (moldlike, filamentous bacteria) « 0 0 Coccus V^1 Frort, or Bacillus Curved forms: Spirillurn/Spiroeriete D if) loc see i (cocci in pairs) Neisserias (coifes-b&an snip* In pairs) //J * / Coccobacilli Vibrios (curved rods) A Telrod* (cocci in packets of 4) • Sarcinae (cocci in packBtB of 8,16,32 cells) Mycobacteria W CorynebacicriJ (palisades arrangement} V Spirilla 'I Streptococci (cocci in chains} sr 4 Micrococci and staphylococci (large cocci in irregular clusters; w V Spore-forming rods Streptomycetes (moldlike. filamentous; bacttna> SA Spirochetes Vibrios (curved rods) Spirochetes Spirilla Lidské oko má rozlišovací schopnost 0,1 mm. Pro mikroskopii lze využít jakékoli vlnění s vlnovou délkou kratší než jsou rozměry objektu. • Pojmy a schémata mikroskopie • A) Optická - zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí viditelného světla 1) Varianty optického mikroskopu 2) Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně např. absorbcí UV i IR světla B) Elektronová C) Akustická Historie mikroskopie Tubulární mikroskop Bratři Janssenové, 1595 Robert Hook 1665 Již olejová lampa ca ANTONr váti L JkbonlvliKyť ImcUAňcykciuT tičíKirkkciw Ě Men Iwofŕmj v,íti ičtíľ HuekJ Ibrviuiciii tliii d Hotk.iĽ iii de leui \ťnisfa;rta|íĽrÍB ttHiřuťt ■ ■< ■■ ■ : Jíufh FnkMt o of i k liuj d:tr hf kkync U'licjíLtl L'ťllí Xl-i \ dach leer v dl kí nim du» T< Nejstarší nákres složeného mikroskopu, Isaac Beeckman, Middelburg, 1625 f cm niijn !jLlpoen en aieTii cudc,' di pien na|_ detkinge nier cíl J arů 3 n't wa.rci ijke Sočj gemaaki ;;íh'Ffaíl lEUWEřítjIpliKS n;"r"n mlieči rc mu koľ' HliuirĽC-cnci\i SftlwpU-jffílk ttfí* ;Ik f «seil lud ■■I -N Ii. ni kupicii, i. wanidfl f. Qi'dl! Hi of due h^bekenr. Antony van Leeuwenhoek 1670 Antony van Leeuwenhoek Jednoduché, zaostřovací šroub, držák. Bez světel. Celkem 419 mikroskopů I Puys -lant.zoo íjc ondcfngE en, zoo doct mém nog in John Yarwell Compound Monocular Microscope (circa late 1600s) 1595 - Zacharias a Jan Janssenovi -1. mikroskop Složený monokulárni mikroskop Van Leeuwenhoekovy „Listy" Kterou mikroskopickou techniku použít? • Její dostupnost • Záleží na mikroskopované struktuře • Tolerance k artefaktům Př: EM - tři hlavní skupinky preparátů mesozomy, filamenta, nukleoid - dehydratace + barvení - ovlivňují morfologii struktur - kryoelektronová mikroskopie - pozorování hydratovaných zmražených buněk Max. zvětšení 1500 X. max. rozlišení 200 nm Stavba světelného mikroskopu * - mechanické součásti - stativ; noha; tubus. revolverový menič objektivů, stolek, makro- a mikrosroub optika mikroskopu (objektiv a okulár) — kombinace čoček: korekce vad osvětlovací zařízení - svetlo prochází objektem - zdroj světla: lampa v noze s kolektorovou čočkou kondenzor - ze 2-3 spojených čoček - soustřeďuje svetelné paprsky na objekt Základem mikroskopu jsou čočky, které tvoří objektiv a okulár. Okuláry a objektivy jsou často výměnné. Vzniká neskutečný, zvětšený a převrácený obraz. okular revolverová hlavice objektivy tubus šrouby pro posun preparátu makrošroub mikrošroub zdroj: www.yiobio.ic.cz Optika mikroskopu Objektiv - je spojná soustava čoček umístěná blíže pozorovanému předmětu. Objektiv má malou ohniskovou vzdálenost (1,5-20 mm). Předmět umístěný těsně před ohnisko objektivu (Fl) je zobrazen objektivem do vzdálenosti, která je větší než dvojnásobná ohnisková vzdálenost objektivu. Tento obraz předmětu je převrácený, skutečný a zvětšený. Obraz může být zvětšen až 150x. Okulár - nachází se blíže oku. Je to spojná soustava čoček, která je nastavena tak, aby sloužila jako lupa. Obraz vytvořený objektivem je promítán mezi mezi okulár a jeho ohnisko (F2). Soustava čoček tento obraz zvětšuje (až 20x). Ohnisková vzdálenost je 10-50 mm. Nezvětšuje již rozlišovací schopnost mikroskopu. Konečný obraz předmětu je zvětšený, neskutečný a převrácený. 250 mm (10 inches) Lens of Eye - Eyepiece Image Formed by Objective Tube Lens Objective Specimen Condenser Virtual Image Vzniká neskutečný, zvětšený a převrácený obraz, Pojmy mikroskopie Celkové zvětšení Z - kolikrát je obraz sledovaného objektu větší než objekt -je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru - omezeno rozlišovací mezí "Empty" Magnification Final magnification using a simple lens system (e.g.: dissecting microscope Same images: Final magnification using a compound light microscope BioEd Online Rozlišení- jak daleko musí být od sebe dva body, aby nesplynuly v jeden Rozlišovací mez - teorie výpočtu vychází z interference prošlých paprsků (E.K. Abbe) 6 = A /ffTTsin a n ...vlnová délka použitého světla - čím vyšší, tím vyšší rozlišení ...index lomu prostředí mezi čelem objektivu a sklíčkem a.........úhel mezi optickou osou 60x Plan Apochromat Objective Manufacturer, Flat-Field . Correction Lateral Magnification Specialized Optical Properties Tube Length Cover Class Thickness Range Cover Glass' Adjustment Cuaue Figure 1 Nosepiece Mounting Thread Aberration Correction Numerical Aperture S '—Working Distance Magnification Coior Code Correction Cellar Front Lens Element Assembly Numerická apertura mikroskopu a kuželem paprsků vstupujích z preparátu do objektivu Objective •Numerická apertura objektivu [NA) n. sin a = součin úhlu dopadu paprsků od objektu do objektivu a indexu lomu - čím je vyšší, tím vyšší je rozlišovací schopnost objektivu, ale nižší hloubková ostrost /orking distance Slide with i specimen Numerical Aperture NA - n • siJMCQ (a) n = 7e NA = 0.12 (b) a = 2Q* NA = D,34 (c) a = 60* NA = 0.67 Pracovní vzdálenost - od povrchu čočky objektivu po krycí sklo Kontrast - rozdíl ve vizualizaci objekt / pozadí Suchý objektiv: Paprsek vystupující z preparátu pod úhlem a se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu. menší index lomu menší numerická apertura vyšší rozlišovací mez n= 1 NA = max 1 Pro žlutozelené světlo: X = 550 nm NA = 0,95 Rozlišovací mez = 0,6 u. m Imerzní objektiv: Paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr cover nemění a může se podílet na glass -tvorbě obrazu. Rozlišovací mez 6 = Á / n . sin a Hooke's microscope R. Hook - po l.olejová lampa Kapalina zvyšuje účinek světla Imerzní prostředí - kapalina o stejném n jako krycí sklíčko. Často cedrový olej (n = 1,52). Imerze umožňuje korigovat některé opt. vady mikroskopu. větší index lomu vyšší úhel a vyšší numerická apertura nižší rozlišovací mez NA = 1,2 - 1,4 Pro žlutozelené světlo: Rozlišovací mez 0,4 u. m • Otvorová vada (kulová, sférická) Čočky objektivu nejsou tenké: různý lom paprsků od optické osy Bodový předmět zobrazen jako • Barevná vada (chromatická) Je způsobena optickou disperzí (závislost indexu lomu na vlnové délce světla). Bodový předmět zobrazován na různá místa optické osy v závislosti na vlnové délce světla. UV —|— Spektrum tzv. bílého světla • + + + + + 350 40P 450 _£00 550 600 650 7Q£L 750 viditelné světlo 800 850 nm Korekce vad Kombinacemi vhodných spojných či rozptylných čoček z různých materiálů o různém n. Rozlišení objektivů dle stupně korekce vad: Achromáty — barevná vada korigována pro 2 barvy světla (červené a modrozelené), otvorová pro žluté Semiapochromáty — barevná vada korigována pro 2 barvy blíže oběma koncům viditelného světla Apochromáty - barevná: nejméně pro 3 barvy otvorová pro 2. Nejdokonalejší objektivy pro bílé světlo Planachromáty a planapochromáty - korigované i zklenutí zorného pole. Význam pro mikrofotografii. Okuláry - typy dle účelu mikroskopie Huygensův Ortoskopické - nezkreslují zorné pole, přesně stejné zvětšení v celém zorném poli. Zejména k měřicím účelům. Kompenzační - kompenzují zbytkové chromatické vady. Periplanatické - odstraňují astigmatickou vadu silněji zvětšujících objektivů. Brillovy- dioptrické Širokoúhlé - průměr zorného pole až 2,5 cm Projektivy - mikrofotografie 4Í. Galileiho okular Í I Huygensův okular ^ 5= - ------ Keplerův okular tí Ortoskopický okular l) Mikroskopie v temném poli - pro zvýšení kontrastu Un-Scattcíed Light |Not -Detected) Sample Plane Microscope Scattered Light [Detected) ApertureStorj - preparát silný pro průchod paprsků - pozorování v odražených paprscích - upravený kondenzor osvětluje preparát zespodu (čočka uprostřed zacloněná) - objekt svítí Light Source 2) Stereomikroskopie - 2 mikroskopy se samostatnými Common M0 Main - Objective l *-* Design I " I ■ " I I ' • • • I ■ • I ' ' • ' v • ■ ' ' I I objektivy a okulary - jejich optické osy svírají určitý uhel I Llgnt So urče - plynulá změna zvětšení bez zaostření ? |ob"tvs (operační mikroskopy) 3) Mikroskopy pro mikrofotografování, pro pořizování videozáznamu s digitálními kamerami, projekční mikroskopy, mikroskopy s mikromanipulátory Objectives Image -r- — Illumination Patli Path illumination Ob] ect Plane Objeol Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí např.UV, IR světla fázově kontrastní mikroskop 1953 - Nobelova cena za objev - Frits Zemike (1888 - 1966) interferenční mikroskop - diferenční interferenční kontrast dle Nomarského (DIC) UV mikroskopie fluorescenční mikroskop Slní-unú |]Hiirsky T)[j mtĽrfĽjícnci I Kimicmvý nástavec Mimcifódný papiek — PVilarmivunĽ SVČtlc] Světici ,-Vzorek -Folťtriíitor Analyzátor— Rádný Osvětlení pm • dcjpaiiaj icí světlo ~ -Objektiv ■ OwEný stol.* OstFiľni Stuliv Filtry Klasický světelný mikroskop: - detaily objektů nejsou rozeznány vzhledem k malému kontrastu mezi strukturami s podobnou propustností světla * Různé části. různý index lomu a ohyb paprsků ill < n2 < n3 "^3 - objekty s vysokým n velmi ohýbají světlo možnost pozorování živých objektů v nativním stavu bez barvení Max lOOOx- 1500x Interferenční mikroskop Obraz: vzniká interferencí obou oddělených paprsků. Bacillus cereus Bacillus megateríum Světelný mikroskop - Jasné pole 'Culture medium - Qra^jJicolle Staling - Enterococcus faecafis + Escherichia co/ŕ(0n^[x 100)^^^/ ** Smíšená kultura G+/G- V* ti Gram Negative Čistá kultura G- V • Pozorování barveného preparátu = mrtvé buňky; dlouhá životnost Max lOOOx- 1500x \, ✓ v i v1 Barvený stěr sliznice - buňky sliznice a buňky bakteriální Observer or camera Ocular lení-<Í — J> VI Aperture array I Objective II Object Objective I Condi lens enser Doposud zmiňované optické mikroskopy (optický + varianty a speciální mikroskopy) vytvářejí obraz okamžitě, jako spojitý celek. Optické mikroskopy vytvářející obraz postupně, z jednotlivých bodů (pixelů) = nesou informaci z úzkého světel.paprsku: 1.laserový řádkovací (rastrovací, skenovací) konfokální mikroskop — _ ■Rušivé světlo z vrstev nad a pod rovinou ostrosti odstraněno z dráhy k detektoru zábranou s malým otvorem - výsledek: perfektně ostrý obraz. Paprsek se po objektu posouvá a obraz jednotlivých bodů se skládá v PC. Posunem paprsku do jiné hloubky lze vytvořit optické řezy a skládat je do 3D obrazu. ■Význam: možnost pozorování i relativně silných preparátů, včetně nativních. ■Konfokální mikroskop lze upravit i pro konfokální fluorescenční mikroskopii CRT display Laser Fi I a mentation by Escherichia coli subverts innate defenses during urinary trad infection. Justice SS1, Hunstad DA, Seed FC, Hultqren SJ. Fi arnentous E. cci/on infected mouse b adder cells. The bacteria were stained with a fed fluorescent nucleic acid dye [ToPro3}and examined under a laser scanning confocal fluorescent microscope. Scale bar: 30 |jm. 2, barevny řádkovací mikroskop „s letící stopou" ■ místo mechanického řádkovacího systému používá jasnou bílou světelnou stopu, která přebíhá po řádcích na obrazovce osciloskopu. ■ Výhody: výborné rozlišení, vysoký kontrast (úpravou jasu zdrojové světelné stopy v závislosti na absorbanci preparátu) 3. optická skenovací mikroskopie v blízkém poli NFOS ■ velmi úzký světelný paprsek prochází po řádcích velmi tenkým preparátem a jsou měřeny změny jeho intenzity. ■ Výhody: rozlišení 10 -lOOx vyšší než u klasického světelného mikroskopu. Výhodou oproti elektronové mikroskopii (viz dále) je, že vzorek nemusí být umístěn ve vakuu ale lze jej pozorovat např. ve vodném prostředí. nositel Nobelovy ceny (1986) za objev elektronového mikroskopu (1931) Elektronová mikroskopie (EM) Zobrazení předmětů pomocí urychlených elektronových svazků - elektrony mají vlnovou délku de Broglieových hmotnost.vln Urychlením lze dosáhnout stotisíckrát kratších vlnových délek: Rozlišovací schopnost pak (o= X /n*sina): velmi malá X Vlivem velkých optických vad použitých čoček (magnetické) poměrně malá numerická apertura n ^H^^řfWanefcwl _ zádově setinv Rozlišovací mez: desetiny nm (mlk) Another casualty in the War of the Atoms. Dělení EM dle způsobu zobrazování transmisní emisní odrazové (v praxi málo používané) řádkovací (skenovací či rastrovací) Elektronový mikroskop Mikroskopická pozorování bakteriálních buněk i utni 1 lim. m 111 1 1" ni I in 100 n til ii.iiiniii.il; r i.ili 1 10n in likioskop I I transmisní ekktrnnovV mikroskop I n m II. 1 ill: radkov.K i ikktľono; \ iniki (iskup Světelný mikroskop - Fázový kontrast Světelný mikroskop -Jasné pole Světelný mikroskop (lOOOx) vs. Elektronový (100 OOOx) t í» ^ ' V Světelná mikroskopie: - .,~ Jasné pole 4f * * Krt Rastrovací elektronová mikroskopie § Transmisní elektronový mikroskop (TEM) Pomocí TEM lze studovat vznik, vlastnosti a vzájemné působení jednotlivých poruch krystalové struktury vzorků. Transmisní elektronový mikroskop (TEM) f" - . „ Oh ^ ía) Jřl5 min f f AgNPs f (1) "attadi to sjrface" W (b) hrin t Mitg; 31200x051» S 00 na Pr int Mrttj: 241UD±^^lnri 50í ni p ^^^^^^30 min AgNPs (c) j ■e ]^B#v fr i n t Mag ; 31208x0 M u ' ■ Print Maq: 31200» f 51 u Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony například uranyl acetát, molybdenan amonný. Transmisní elektronový mikroskop (TEM) V biologické praxi: Z 5 000 -100 000 rozlišení: desetiny nm (větší molekuly) Struktura objektu: průchodem el.svazku Elektronový paprsek: ze žhaveného kovového vlákna Proti rozptylu elektronů: v tubusu EM vysoké vakuum Čočky vytvářeny obvykle rotačně symetrickým elmag. polem Konečný obraz pozorujeme nepřímo, projekcí na luminiscenční stínítko elektronové dělo Čočka kondenzoru preparát Čočka objektivu Čočka projektivu stínítko Nevýhody: speciální postupy pro fixaci a barvení; vakuum;vysoký tlakjako „barviva'': soli a oxidy těžkých kovů, nutno rozlišit artefakty vzniklé zpracováním preparátu. Procházející elektrony se zachycují a obraz se zvětší a fotografuje. Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony například uranyl acetát, molybdenan amonný. Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) Popularita SEM pramení z možnosti získat obrázky povrchů širokého spektra materiálů, které jsou navíc jednoduše i nte r p retovate I n é. Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) > velmi úzký paprsek elektronů je vychylovacím systémem nucen přejíždět po povrchu preparátu po řádcích • Rozlišovací schopnost SEM o 1-2 řády menší než TEM, ale možnost pozorování objektů s komplikovanou 3D strukturou (signál totiž nese informaci o sklonu povrchu v místě dopadu svazku elektronů) výsledkem je obraz s vysokou hloubkou ostrosti Nevýhody: pokovování povrchu preparátu, složitá fixace. Problém rozlišení artefaktů vzniklých zpracováním preparátu Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu), tence potaženého paprskem iontů kovu, například platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem, v místech, kde se kovové ionty nedostanou vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz. Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tunneling electron microscopy, STM) Nad povrchem preparátu se pohybuje velmi tenký kovový hrot, ke kterému „tunelují" elektrony z povrchu preparátu (tunelový efekt - jev kvantové mechaniky, kdy částice pronikají oblastí, na překonání níž by dle zákonů klasické mechaniky neměli dostatek energie) Zobrazuje se elektronová hustota na povrchu preparátu s rozlišením na úrovni rozměrů atomů. Výhody: Vzorky nemusí být ve vakuu, ale např. i ve vodném prostředí. Vynalezen v laboratořích IBM v Zúrichu G. Binnigem a H. Rohrerem r.1980 1) jehla s extémně ostrým hrotem (pohybovat v řádcích -nanometry) 2) Na hrot je ze zdroje 3) přiloženo elektrické napětí vzhledem ke vzorku, jež může díky tunelovému efektu odsávat elektrony. 4) Výška hrotu nad vzorkem nastavována piezoelektrickým systémem 5) Proud snímaný jehlou měřen citlivým měřidlem 5) a je využit k tomu, aby se pomocí regulátoru 6) udržovala výška hrotu nad povrchem vzorku konstantní, jak je vyznačeno na obrázku čárkovanou křivkou 7) Hrot tak s extrémní přesnosti mapuje výškový profil vzorku. Další zpracování je pak záležitostí počítače 8). Systém je schopen rozeznat jednotlivé atomy na povrchu vzorku. Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) Akustická mikroskopie UFM - Mikroskopie ultrazvukových sil akustický mikroskop - zařízení, které vysílá na vzorek řádkovacím způsobem ultrazvukový signál, odezvu převádí na elektrický signál a na monitoru prezentuje rekonstruovaný videoobraz • Hyperzvuk proniká v kapalinách i pevném prostředí do hloubky jednotek až desítek mikrometrů. • Pozorování preparátů neprostupných pro elektrony a viditelné světlo. • Informace o mechanických vlastnostech prostředí. Kam se podívat... • Kabinet elektronové mikroskopie - Technické muzeum Brno • AVČR - Ústav přístrojové techniky Muzeum oddělení Elektronové optiky ÚPT AVČR Obrazová dokumentace a zpracování obrazu • Rozdělení obrazu • Zařízení • Komprese a formáty obrazu • Programy - analýza obrazu (LUCIA,NIS) Fialová barva, která je získána součtem červené a modré barvy, je znázorněna bodem o souřadnicích [1, 0, 1]. Bílá barva, reprezentovaná vrcholem [1, 1, 1], je složena z barevných vektorů v červeném, zeleném a modrém vrcholu. Odstínům šedi odpovídají body na diagonále krychle spojující černý a bílý vrchol. Zdroje: - Campbell N.A. a kol. (2006): Biologie, Computer press, Brno - Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 - Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy - Hrazdira.L, Mornstein V. (2001): Lékařská biofyzika a přístrojová technika, Neptun, Brno - Rosypal a kol. (1999): Uvod do molekulární biologie, Brno