Analýza exprese microRNA Doc. MUDr. Mgr. Marek Mráz, PhD Vedoucí laboratoře CEITEC MU a FN Brno 10/18 Moderní metody analýzy genomu 1 • Nic si nepište…vše bude online 2  krátké RNA molekuly ~22 nukleotidů  komplementární vazba k cílové mRNA  inhibují translaci a snižují stabilitu mRNA microRNA (miRNA) microRNA DNA mRNA PROTEIN • Lidské miRNA geny: cca 2000 Stovky evolučně konzervovaných microRNA Mraz et al., 2010 3 courtesy of F. Slack 4 5 Genomic Organization of miRNA Genes Zhao Y, Srivastava D, TIBS 32:189,2007 •Intronic miRNAs often in antisense direction, made from own promoter •Exonic miRNAs - non-coding (or in alternatively spliced exons) miRBase http://www.mirbase.org/ miRNAs as Oncogenes and Tumor Supressors Zhang et al Dev Biol. 2007 Feb 1;302(1):1-12 microRNA DNA mRNA PROTEIN mRNA neznamená, že v buňce bude i protein Historicky vždy velká neshoda mezi daty z expresních čipů a expresí proteinů (Western Blot) 9 Specifika analýzy exprese microRNAs: o velmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond o malé zastoupení ve vzorku – separace microRNA o v lidském genovu cca 2000 genů o některé mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt o pre-miR, pri-miR, mature-miR o málo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků o zatím málo zkušeností a standardizace Izolace NGS Real-Time PCR Microarrays 10 1/ Izolace a stabilita microRNA Problémy: velikost 22nt, celkově cca 0,01% z celkové RNA Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Obohacení: PAGE FlashPAGE Fractionator (Ambion) Mraz et al., 2009 11 Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Mraz et al., 2009 12 RT-PCR Problems….? TaqMan-based real-time PCR quantification of mature miRNAs 14 Stabilita microRNA : Stabilita po izolaci Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Mraz et al., 2009 RNA cDNA Bravo et al., 2007 15 Stabilita microRNA : Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Jung et al., 2010 16 RNA Seq Next Generation Sequencing • Takes advantage of miniaturization to engage in massively parallel analysis – Essentially carrying out millions of sequencing reactions simultaneously in each of 10 million tiny wells • Sophisticated computer analysis of huge amounts of information allows “assembly" of a given sequence Massive Parallel Seq workflow 1) Library preparation 4) Data processing & analysis A SAMPLE 2) Cluster generation on a flow cell SE, PE reads, 50-250 bases (miseq) 3) Sequencing & imaging 20 High Parallelism is Achieved in Polony Sequencing PolonySanger This is the trick C A G T C A T C A C C T A G C G T A 5’ G T C A G T C A G T C A G T 3’ 5’ First base incorporated Cycle 1: Add sequencing reagents Detect signal Cleave terminator and dye Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat Sequencing by synthesis A C G A A A T T T T C C G G G G G C T A Emission Excitation 37 Sequencing by Synthesis - Fluorescently labeled Nucleotides (Illumina) Complementary strand elongation: DNA Polymerase video • https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM The general experimental procedure for RNA Transcriptom = sum of all RNA (mRNA, rRNA, tRNA and noncoding RNA) The general experimental procedure for miRNA The general experimental procedure for miRNA 42 43 MICROARRAYS Expression microarrays pro microRNAs: o velmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond o malé zastoupení ve vzorku – separace microRNA o v lidském genovu cca 2000 genů – menší počet sond na čipu o některé mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt o pre-miR, pri-miR, mature-miR o málo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků o zatím málo zkušeností a standardizace 1. 2. 3. Li and Ruan, 2009 44 3/ Labeling – značení:  Není možný labeling pomocí značených polyT při reverzní transkripci  Přímé značení (direct labeling) – většinou nějaká fluorescenční barva  Nepřímé značení (indirect labeling) – probíhá nějaká reverzní transkripce/PCR Přímé značení: Jednoduché, rychlé a „čím méně kroků tím méně vnesených chyb a variability“ 1/ Značení guaninu v microRNA Flurochromem vážícím se na guanin jsou označeny miRNA (Ulysis Alexa Flour 546/647) Všechny lidské miRNA obsahují guanin, ale v různém množství Nemožnost usuzovat na vzájemnou expresi různých miRNA (různý obsah guaninu) (Babak et al., 2004) 2/ Značení pomocí Poly (A) polymerázy Můžu se rozhodnout jak dlouhý bude poly(A) a tím ovlivnit sílu signálu (Shingara et al., 2005) 45 4/ značení pomocí T4 ligasy Krátký značený oligonukleotid je připojen T4 ligásou k 3‘konci Výhodou je přednostní vazba na RNA o velikosti 18-30bp ->total RNA (Thomson et al., 2004; Castoldi et al., 2007) 46 Nepřímé značení: Značen je produkt reverzní transkripce či PCR Výhody: cDNA je pak stabilní a lze uchovat, Pre-amplifikace a tím snadnější detekce méně exprimovaných miRNA 1/ značení revezního transkriptu miRNA Reverzní transkripce pomocí náhodných 8-merů značených 2 biotiny (3‘-(N)8 – (A)12-biotin-(A)12-biotin-5‘ (Liu et al., 2004) Reverzní transkripce pomocí náhodných neznačených 7-merů, následně označeny s pomocí terminální transferázy a biotin-dideoxy-UTP (Sun et al., 2004) Nebezpečí chyb z nespecifické vazby primeru 2/ značení produktu RT-PCR Výhoda: snadná pre-amplifikace Dva adaptory fluorescenčně-značený primer (k adaptoru) (Miska et al., 2004) Nevýhoda: antisense strand přiromen při hybridizaci Rešením je různá délka sense a antisense ->PAGE (Baskerville, 2005) 47 3/ Microarrays/ Próby: Problémy: krátké RNA, malé rozdíly v sekvenci, Tm 48 Tm – melting temperature určité próby T – hybridizační teplota TmT ..........vyšší efektivita vazby miRNA Je třeba navrhnout próby tak,aby měly všechny podobnou Tm To se u „dlouhých“ mRNA řeší vhodným výběrem oblasti genu k němuž bude sonda komplementární nebo délkou sondy  navíc některé miRNA jsou téměr sekvenčně totožné 49 Li and Ruan, 2009 ÚPRAVA SÍLY VAZBY NUKLEOTIDŮ LNA próby (Locked Nucleic Acid) ribózový kruh je „uzamčen“ methylenovým můstkem mezi atomy 2´-O a 4´-C Použití LNA pro některé báze v próbě 50 SÍLA VAZBY: LNA vs DNA próba Tm až 720C (Castoldi et al., 2006) 51 SPECIFITA VAZBY: LNA vs DNA próba (Castoldi et al., 2006) 52 miRCURY LNA Array, Exiqon : 3 dny 53 Co se nemusí podařit: Nekvalitní RNA Nepodaří se značení Nepodaří se hybridizace Nepodaří se promývání Technická variabilita čipů je větší než ta biologická Nepodaří se validace dat pomocí RT-PCR, atd Práce s miRNA čipy je velmi obtížná. Všeobecně nižší míra standardizace. Obtížná interpretace získaných dat z pohledu biologického smyslu např. deregulace několika miRNA (nádor vs. zdravá tkáň apod.) 54 55 ODPOČINEK? courtesy of G. Calin microRNA DNA mRNA PROTEIN 56 courtesy of F. Slack 57 microRNA exprese je schopná rozlišit původ nádoru Lu et al. Nature 435: 834, 2005 58 59 60 61 62 courtesy of S. Hammond courtesy of S. Hammond Chronická lymfatické leukémie  Z maturovaných B lymfocytů  Nejčastější leukémie dospělých  Extrémně variabilní prognóza  Nejčastější aberace del13q14 – obsahuje 2 miRNA (miR- 15a, miR-16) Exprese miRNA asociuje s prognostickými subtypy CLL Calin et al., 2005 Fulci et al, 2007 Zenz et al., 2009 Stamatopoulos et al., 2009 Mraz et al., 2009a, 2009b, 2012, 2014 Mutované IgHV Nemutované IgHV Delece/mutace p53 ~ 20 miRNAs n =168 Nižší hladiny miR-150 asociují s kratším celkovým přežitím a časem do první léčby Mraz et al, Blood, 2014 Jak identifikovat cíle miR-150 u CLL? (HG-U133 Plus 2.0, Affymetrix) N=32 N=32 Mraz et al, Blood, 2014 Genové expresní čipy pro CLL s nízkou vs vysokou hladinou miR-150  58 rozdílně exprimovaných genů  2 geny s evolučně konzervovanými vazebnými místy pro miR-150– GAB1 a FOXP1 GAB1 je adaptorová molekula, která je nutná k vazbě PI3K na membránu a amplifikaci BCR signalizace (Ingham et al. JBC, 2001). FOXP1 je transkripční faktor důležitý pro vývoj B lymfocytů a asociovaný s ABC DLBCL a progresí B buněčných lymfomů (Hu et al. Nat Immunol, 2006). Adaptivní imunity- centrální dráha BCR B cell receptor (BCR) GAB1 P P P P SHIP SHP1 FcγRIIB PIRB CD22 BCR Igα Igβ LYN SYK BTK BLNK PLCγ2 PI3K SHP1 „Negative regulators of BCR“ CD19 P P P RAS P38 MAPK NFκB AKT ERK/ ↑Ca2+ FOXP1 miR-150Pro- proliferative and anti- apoptotic pathways activated by BCR „Positive regulators of BCR“ Mraz et al, Blood, 2014 Popsali jsme první příklad regulace BCR signalizace prostřednictvím microRNA Kater and Eldering, BLOOD, 3 JULY 2014 x VOLUME 124, NUMBER 1 First description of miRNAs role in BCR signalling…not only in CLL miR_terapie • potentially usefull as therapeutic targets 74 75 Díky za pozornost Marek.Mraz@email.cz Ceitec.cz/mrazlab Hledáme nadšené studenty (Bc, Mgr, PhD) a post-doky CEITEC MU Mraz Lab: Katerina Cerna, Katerina Musilova, Vasek Seda, Gabriela Pavlasova, Veronika Svobodova, Sonali Sharma, Jan Oppelt 77