HEMATOPOÉZA - HEMATOPOETTCKE KMENOVÉ BUNKY - HSC (hematopoietic stem ce\\s) - Hematopoéza je v současné době zřejmě nejlépe prostudovaná diferenciační dráha s nej dokonalejším fenotypovým rozlišením jednotlivých buněčných stádií buněk založeno na tzv. CĎ (cluster determinants) antigény. - Jednotlivé diferenciační dráhy jsou často majoritně závislé na jediném cytokinu (kolonie stimulujícím faktoru - CSF; např. G-CSF, faktor stimulující tvorbu zejména granulocytů) - V průběhu ontogeneze je hematopoéza realizována jedinečným způsobem (časově a prostorově, viz. níže), což dobře umožňuje i studium rozdílů mezi embryonálními a adultními somatickými kmenovými buňkami. Každopádně již v průběhu embryonálního vývoje vznikají jisté typy populací ve smyslu „fakultativních kmenových buněk" (některé tkáňové makrofágy, mikroglie, různé typy lymfocytů). - HSC vzniklé ve žloutkovém váčku také migrují do oblasti AGM a do jater, kde dávají vznik adultním HSC (Samokhvalov, 2007) Hematopoetické kmenové buňky - HSCs (hematopoietic stem cells) (Hematopoéza) HSC(GO) HSC L-blast Mo-blast • * Lympho Mono cyte cyte Progenitor Pro-M Myeloblast Myelocyte Meta-M (band) % (seg) Neutro phil Progenitor Promegakaryo cyte Ortho-E t I Eosino Baso Erythrocyte phil phil Platelet CD antigens (I)ll7t lib- CTCSSa*" ( l)H7t Hb-/+ < 1)36 •"«'■ 01)235«* (1)117- Hb+ hi. CD36"-"' CD36k-h C/n235u*"» C'I»235n**,• orttiof hrowitlf vrythrnblust (1)16+ (1)163+ (1)4+ (1)13+ CDI5+ CD33++ (1)36« CD64+ RLA-DR4 CDllb+-+-( 1)14« ' l.ill- (1)34+/- CD34- CD34+ CD38+-/- (1)38+ (1)38- CD6I + CD6I-+ (1)123- (1)41 + ( 1)41« ( D45KA- (1)42- CD42+/- Tl»()-R+ (1)34- CD38++ (1)61+-+ CD41+-+ (1)42« III..I III r mcKiikuryocytc Rozlišujeme LT-HSC (long-term HSC) - schopné opakovaně kompletní obnovy hematopoézy (vyžadujíosfeoblasfy), Kostní dřeň - <0.01% buněk ~ 98 % v G0 fázi buněčného cyklu ST-HSC (short-term HSC) - schopné jen krátkodobé obnovy hematopoézy (vyžadují endotelie - vaskulär ní niche) ~ 1- 3% pro I if erujících (aktuální X potencionální' (proliferující) kmenová buňka) Harrison et al. (1979): transplantoval myším opakovaně identický štěp HSC déle jak 8 let - > výrazné překročení délky života myši!!! - > OPRAVDOVÉ AĎULTNÍ KMENOVÉ BUŇKY! Dělení hematopoietických buněk Feedback signal regulates self-renewal ..... ... - . ** long-term short-term multipotent commited repopulting repopulting progenitor progenitor precursors mature cells stem cells stem cells cells cells (CPC) (LT-HSC) (ST-HSC) (MPC) Množství potomků reguluje intenzitu dělení mateřských buněk, hlavní úloha růstových faktorů. B Symmetric differentiating cell division Asymmetric cell divisions Symmetric self-renewing division \ t Differentiation LT-HSC ST-HSC MPC 1st 2ai CO c o CO ■> •B o n E 3 d) O c 0 O CO o> d) CO > CO o Q. 0 >nd 2a i 3rd 2a, ith 2a, ;th 2a 1 6th 2a 1 7th 2a 1 A1 1 A2 i » A3 l A4 I A5 1 A6 i A7 49 th 2a 1 50 th A49 \ A50 100di 100dj 10Ôä B1 i B2 i B3 i B4 i 100di 100di 100d< B5 i B6 i B7 '4 T 100dÄ B49 I B50 10d| 10dl I0d| 10d| 10d| 10d{ i0d< C1 l C2 i C3 1 C4 I C5 C6 i C7 ♦ ■ '4 T 10di C49 I C50 CPC precursors mature cells 5dQ D1 I 5d Q D2 5d 1 D3 ^) 2d^ 5d D4 i D5 i 5dQ D6 i 5dO D7 ■ ♦ ■ A T ■ \; 5dQ D49 i O D50 2d Q E1 I -O E2 2d Q E3 2d E4 I 2dO E5 i 2d Q E6 I 2d Q E7 44 ▼ 2d Q E49 i O E 50 F2 „20d P 20d F3>* 20d F4 F5 20d ,20d 20d F7 N* ♦A F49 F50 20d 20d Doba existence buněk v jednotlivých vývojových stádiích hematopoésy (Rychlost dělení není ukázána!) Hematopoietic Stem Cell Differentiation Hematopoietic stem cell Self-renewal i Myeloid stem ceil Self-renewal Self-renewal Committed precursor cells Cytokines M-CSF Differentiated cells Monocyte/ Lymphoid stem cell Differentiation macrophage Granulocyte Eosinophil Red blood cell Platelets IL-2 IL-12 Others I J Tcell Bi 1 :ell IL=interleukin Epo=erythropoietin GM-CSF=granulocyte/macrophage colony-stimulating factor SCF=stem cell factor Q-CSFxgranulocyte colony-9timutating factor Tpo»thrombopoietin M-CSF=monocyte colony-stimulating factor © 2005 Cassio Lynm. To obtain permission of use please contact www.cassio-lynm.com Hematopoiesis Pluripotent stem cell V GFU-GEMM CFU-MEG IL-3 BFU-E IL-3 GM-CSF CFU-E IL-3 GM-CSF^ Megakaryocyte GFU-Eo THYMUS IL-3 GM-CSF GM-CSF CFU-GM GM-CSF Epo I i IL-3 GM-CSF IL-3 GM-CSF GM-CSF IL-3 M-CSF TG-CSF T IL-3 i i Red blood Monocyte Granulotcytes B eel Platelet Tcel ■;ei M-CSF yGM-CSF Macrophage s4> CP BFU4 clercved colony (erythroid) CPU GM derived colony (myeloid) CFU Meg derived colony (megakaryocyte) Erythrocytes Platelets Neutrophils Monocytes Eosinophils ' -v Basophils Stem Progenitor Precursor Mature cell cells cells cells Příklad kolonií hematopoézy v in vitro experimentu Palis 1999 Ep - primitivní erytropoéza, MAC - primitivní makrofagy, BFU-E - (Burst-forming unit erytroidní) z fetalních jater, GM - granulocatarní-makrofagova kolonie Fenotyp HSC (mouse) antigen HSC Myeloid SC Lymphoid S C CD 10 (C ALL A) - - + CD33 (Sialoadhesin) - + - CD34 (L-selectinR) + (-) + + CD38 (ecto-ADP-ribosyl cyclase) - - + CD90 (Thyl) + - + CD110 (Trombopoietin receptor) + + - CD111 (Nectinl) - + - CD112 (Nectin2) - + - CD117 (c-Kit, SCFR) + + + CD 123 (a řetězec IL-3R) + + - CD 124 (IL-4R/IL-13R) - - + CD 127 (a řetězec IL-7R) - - + CDwl31 (P řetězec IL-3R/IL-5/GM-CSF) - + - CD133 (Acl33) - + - CD135 (Flt3/Flk2) + - - CD173 (krevní skupina H typ 2) - + - CD174 (Lewis Y) - + - CD 176 (Thomson-Friedrenreich antigen) - + - CD227 (MUC-1) - + - CD228 (Melanotrensferrin) - + + CD243 (MDR-1) + - - Schema hematopoézy a fenotyp aktuálních a potencionálních HSC - mouse Self-renewal Stem cells Mult i pote nt progenitors Oligopotent progenitors Lineage-restricted progenitors Effector cells ÍÓ) MEP o o ^ LT-HSC (LIN" KIT4" SCAr CD3410 FLK210) 4 ®ST-HSC (LIN" KIT4" SCA1* CDMHi FLK2Lo) Í (LIN" KIT4" SCA14- CD34Hi FLK2Hi) (^S) CMP Erythrocytes Platelets Granulocytes Macrophages T cells Mouse Human Hematopoietic Hierarchy HSC ^ Long-term ^ s^J Self-renewal Llnc-KifScarFlk2 CD34 Slamtr LlnCDWCD38CD90,CD45RA ( Llnc-Kit,ScarFlk2,CD34,Slamf1 / Q> I © I (Lin c-Ktf Scar Flk2h'CD34,Slamflj ^/ q > Multipotent Progenitors / ( Llnc-Krt^Scat'lLTRg' Flk2") / ( LlnCD34>CD38•CD10• j ' ( Linc-KifScal CD34'Fc-.K :*) (Lin C 034 * CD38' I L3Ra' ^ C D45RA) y MEr> ( Lin c-Kif Scat CD34Fc?R ) WCD34,CD38,IL3Rg CD45RA) ( Lin C-Ktf Seal CD34 F (LlnCD34,CD38-|L3RaCD45RA) CLP v Ollgopotent Progenitors Pro-T Pro-NK Pro-B © © e i i i © e o Lineage restricted Progenitors Mature effector cells Erythrocytes Platelets Granulocytes Macrophages Dendritic T-cels NK-cells B-cells cells Critical transcription factors for blood development C W — O O ü Is Q. « LT-HSC renewal, 4^ Runx-1 Scl/Uil-1 Lmo-2 Mil Tel Bml-t GV1 GATA-2 Stem coll class Required for production, survival, or solf-renewal of HSCs 0) o S ■ 5 Q. MEP GATA-1 GATA 2 FOG-1 "O 40 i i E 3 E 0 o£ o a GAÍA-1 FOG-1 6fi-1b EKLF GATA Gfi CMP JL. GMP GATA-2- GATA-1- o w 3 •»* (6 RBC Megakaryocyte it * I» .» Platnlets Gli-1-e •C.-EBPl — CLP fc2A EBF Ben la lEv.9) Notcrv-«S> TCr-1-GATA-3-«> xt:c-i- té w m Mast cell Eosinophil Neutrophil Monocyte/ Macrophage B lymphocyte T lymphocyte Fli-1 NI E2 Extrinsic a intrinsic faktory regulující sebeobnovu adultních HSC (Akala A Clarke 2006) významnou úlohu hraje hypoxie a HIF! HSC mají vysokou hladinu HIF nezávisle na hypoxii! - úloha cytokinů SCF, IL-x? Bmil - polycomb group protein PTEN - inhibitor PI3k/Akt p!8, p21 - inhibitory cdk STAT5 - signalizace cytokinů HoxB4 - transkripční faktor specifikující linii hematopoézy Self-renewal HSC Ukázka heterogenity ve fenotypu jednotlivých buněk na základě exprese klíčových transkripčních faktorů zapojených v regulaci hematopoézy jako jsou Flil, PU.l a Myb. A Runx1+23GFP transgenic embryos E10.5 AGM/VUA region Endothelium FM J .................. VEcad+Runx1+23GFP- pu.1 Ter119- CD41- CD45- Myb |||||(||||||||||||| Haemogenic Endothelium VEcad* Runx1+23GFP* Ter119- CD41- CD45- MYb FH1 PU.1 Committing HSPC Fli1 VEcad* Runx1+23GFP+ PU.1 Ter119-CD41*CD45- Myb Mature HSPC Fli1 VEcad* Runx1+23GFP* PU.1 Ter119-CD41*CD45* Myb Gene expression (ACt) •10 -6 Not —■ detected •6 -4 0 2 4 -1 High expression Flil - Fli-1 Pro to-Oncogene, ETS Transcription Factor / Friend leukemia virus integration 1 ^^4548588982198^685982929024247548485802 9999999999999999999999999999994^ 2548^0588982923294244045585^5959829294244546 24244545485889 \ SNO cell N-cadherin CD45- HSC 71e24 Lin Sca-r c-kiť N-cadherin* CD45- Mobilizatior Sinusoidal vessel Recruitment HSCs/HPCs (FQF-4. SDF-1) CP sKitL MMP-9 Stress-►SDF-1. VEGF Myeloid cells Megakaryocytes C Toulatlon Endothelial cells Osteoblast Homing J Osteoblast niche FGF-4 Oxygen Vascular niche J Bone Endosteal Bone marrow Mobilizace HSC (přechod HSC do periferní krve) - působením G-CSF, SCF, IL-3, TPO G-CSF - granulocyte colony-stimulating factor, SCF - stem/steel cell factor, IL-3 - interleukin 3, TPO - trombopoetin Yin & Li 2006 Osteoblastic Niche II Vascular Niche Endosteum Zone Central Marow Zone Bone SNO 0 C Endosteal quiescent-storage niche HSCinC. >—<- 0 Non specialised strom.il cell C 0 Endosteal self-renewing niche ' (HSCJ( lonq renewal 0 >—< Divisional asymmetry o COS } ( 000 ("nvironmental asymmetry Bone marrow Vascular niche Lonq term veil renewal? Sinusoidal cndothi-li.il i «11 Differentiation into megakaryocytes, erythrocytes and myeloid cells Migration to the thymus and diffiTfnti.il ion into thymocytes Differentiation mto B cells that migrate to stromal cells in the bone marrow expressing CXCL12 Změna niche - ztráta kmenovosti = diferenciace - změna statusu - quiescence x proliferace Copyright © 200b Nature Publishing Group Nature Reviews | Immunology Model významu angiopoetinu v regulaci sebeobnovy HSC Ang - angiopoetin Tie2 - receptor angiopoetinu Vn^l/I U-2 Maintains tlu» "Stemncs*" (Minlcll TlEÍ OA HSC (SP) _V r/iř,^.n_.,in.ir.n'; SELF-RENEWAL (Arai F, 2004) Reaktivní kyslíkové metabolity (ROS - reactive oxygen species) regulují aktivitu HSC - zvýšení produkce ROS vede k indukci proliferace a opuštění niche => úbytek HSC => zvýšení intenzity hematopoiésy Osteoblastic niche Vascular niche Blood vesiel MyeloNupprcwion ATM or POXO Serial BMT Detachment Defects of stem cell function from the niche Exhaustion of stem cells Původ HSC Podíl jednotlivých tkání na celkovém objemu hematopoézy mezi 11-13 dpc u myši I YS □ AGM Ü Circulation I Liver Embryo Age (days) 11 Total HSC 40 12 Mill 13 2675 Pozn. Slezina je osídlena HSCs a hematopoetickými progenitory pravděpodobně z jater, protože v době objevení se hematopoézy ve slezine, v žloutkovém vaku a v aortě už hematopoéza neprobíhá a kostní dřeň dosud není vyvinuta. Místo vzniku krevních ostrůvků (blood island) v průběhu embryogeneze u myši EPC -cavity Q* EPC Trophoblast giant cells Chorionic ectoderm Allantois Visceral endoderm Definitive endoderm Yolk cavity E7.6 Schema vyvoje AGM (aorta-gonads-mcsoncphros) - zacdtek f etdlni hematopoezy Ectoderm Mesoderm Endoderm f | Somatopleura | Splanchnopleura MOUSE Lokalizace, změna „niche" u hematopoézy v průběhu ontogeneze Vznik krevních ostrůvků vc vznikajícím žloutkovém vaku mezi mezodermem a buňkami viscerálního entodermu visceral endoderm mesoderm 7.5 dpc 0 11 -l V 1 .11 I |](t<»Ir I 1II llll Mllll (III \ endothelial cell e t-rithrittiLisl lilcniil islands HSC CFü-GM BFU-E Hematopoéza v endotelu aorty (AcSM), ~10.5 dpc JATRA 11 dpc (1)34. (1)31. VI-Cadherin, Fill. Flk-1/K1)R. Tie2. AA4.1. Endothelial* Ľ.kii. vWF, SCL, AML11, CbU GATA2.VECF Hematopoietic Intra-aortic Cluster CD45, CD164, CD43, CD44. CD41, CD34, CD31. AA4.1, VF.-cadherin. c-Kit, C-Mpl, g|>130, G-CSFR, TIE2. CXCR4, Flt-I. Flk-l/KDR?. cMyb. LM02. SCI., AMD, G ATA 2, GATA3 Ventral Spin nihiiopk-ii ml Mesoderm Subaortic Mesenchyme' BMIM.GATA3. VA4.1, 11 nás* in C, CD 166, smooth muscle-a actin, Sca-I, AML1, G ATA 2. SDF1. VEGF. i c-Kit Ugand. II.-6, OSM. Tpo Kostní dřeň, ~15 dpc S vývojem kostní dřeně se HSČs usazují v jejím stroma. THYMUS pT, pB - lymfocytární progenitory CFU-6M - myeloidní progenitory BFU-E, CFU-E - erythroidní progenitory Embryonální hemafopoéza (mouse) Dzierzak 2008 Embryonální hematopoéza (mouse) Hemangioblast Hemogenic endothelium Primitive Pro-definitive Meso-definitive Meta-definitive Adult-definitve Myeloid Lymphoid-myeloid CFU-S HSCs Neonatal HSCs Dzierzak 2008 Embryonalni x adultnf HSC'(mouse) Mesoderm ,rbc # tt • • • T:rBC * * • ♦ + mmm%\) \—I—I—\ \—I—I—\ 6.5 7.5 Gastrulation B.5 9.5 10.5 11.5 12.5 lulation I Liver Colonization Days ^Circulation ^Liver Palis 1999 CFC - colony-forming cell (progenitor), CFU - colony-forming unit Developmental time Site Functional activity PrirnitvQ E7.5 Yolksac3 Primitive erythnoid E7.5-E6 tO^sp) Yolksacb Primitive erythroid Pro-definitive E7.5-ES(EHF-2sp) Allantois3 Erythroid-myeloid progenitor E7.5-E8 £0-7sp) Allantois3 Erythroid-myeloid progenitor E&.25 Yolksac3 Erythroid-myeloid progenitor E&.25 Yolk sac* Erythroid-myeloid progenitor E9.5 Yolksacb Erythroid-myeloid progenitor E9.0 Placenta Erythroid-myeloid progenitor Meso-definitive E7.5-E9 fO-Sspl pSpa Erythroid-myeloid-lymphoid progenitor E7.5-E 8 (0-5ap) pSpa Mu It i potent low-level repopulating progenitor Meta-definitive E9.0 Yolksacc Neonatal repopulating HSC E9.0 AGMC Neonatal repopulating HSC E9.0 Yolksacc CFU-S E9.0 AGMc-d CFU-S Adult-definitive E10.5 AGMd'B Adult repopulating HSC EL0.5 Umbilical and vitelline vessel sd Adult repopulating HSC E10.5-E11 Placenta Adult repopulating HSC Rozdíly mezi embryonálními a adultními HSC Intenzivně proliferující HSC pomalu proliferující / quiescentní HSC A Primitive streak i-1— PRENATAL Yolk sac. AG M —I- Fetal liver POSTNATAL Bone marrow E7.5 E10.5 I Runxl E12.5 E15.5 Birth 4 weeks 8 weeks Sox 17 Gfi-1 I Tel/Etv6 Obnova embryonální hematopoézy Obnova adultní hematopoézy Jang& Sharkis2007 Transkripční faktor RUNX1 a vývoj HSC • Knockout pro RUNX1 u myší způsobuje embryonální letalitu E12,5. Embrya postrádají hematopoézu ve f etálních játrech. • RUNX1 důležitý pro vznik HSC z hematogenního endotelia Chronologie hematopoézy u člověka a myši hematopoéza/ lymfopoéza (dny) člověk myš embryonální vývoj (dny) -270 -21 žloutkový vak 18 7.5 dorsální aorta 27 9.5 fhymus 40 11 játra 42 11 slezina 48 13 kostní dřeň 77 15 cirkulace krevních buněk 24 8.5 v Časování cest lidských HSC 4-5 weeks AGM Region 9-10 weeks Thymus 5 weeks /-v Lii/er 2-3 weeks Yolk Sac <_j \ í-/5 weeks Bone Marrow 15-1B weeks Lymph Node 74 weeks Spleen S3 — o res 0 si — Intenzita hematopoésy v průběhu embryogenéze u člověka yolk sac --- liver —— spleen .......... lymph nodes >—°- bone marrow y^"' 1 2 3 4 5 6 7 lunar months o I 3 4 months gestation birth Medsrapeowww.medscape.com Source: Cancer Control £ 2004 H. Lee MofTitt Cancer Center ard Research Institute, Inc.