Neurální kmenové buňky – NSCs
(Neural stem cells)
lokalizace NSCs
a)
b)
a) subventrikulátní zóna (SVZ), postranní komory
b) subgranulární zóna DG
Gl – glomerularní vrstva
Gr – granulární vrstva
EPl – vnější plexiformní vrstva
Mi – vrstva mitral buněk
IPL – vnitřní plexiformní vrstva
cc - corpus callosum
LV - lateral ventricle
CPu - caudate putamen (striatum)
DG - dentate gyrus
SN - substantia nigra
Neurogeneze v dospělosti!
(hlodavci (savci obecně??), zpěvní ptáci)
 neurogeneze v důsledku březosti ♀
 neurogeneze v době vábení ♂
 neurogeneze regulovaná hormony
RMS – rostrální migrační tok
(rostral migratory stream)
(- u člověka neověřeno?!)
C
(TA)
A
(neuroblast)
migrace
E
(ependym)
?
radial
glia*
astrocyt
glia
prekursor
neurony
oligo-
dendrocyt
Shh; Delta/Notch -> Hes
Sox1, 2, 3; Emx2;
Zic1; Pax6
Oblast s NSCs obsahuje čtyři typy buněk
1) pomalu proliferující, astrocytům podobné (GFAP+/nestin+/SSEA1+/CD133+)
buňky - typ B = NSCs (přesný fenotyp není dosud úplně objasněn - ±GFAP??, ± nestin ??)
2) spící, případě potřeby intenzivně proliferující buňky vzniklé z buněk B - typ C
(TA progenitory, přechodně/transientně se dělící progenitory)
3) z buněk typu C vznikají buňky A = neuroblasty
4) ependymální buňky - typ E
B
(NSC)
*radiální glie – embryo
a časně postnatálně
EGF (in vitro)
embryo
EGF+FGF2 (in vitro)
STAT3 -> Delta
Fenotyp neurálních kmenových buněk
„Niche“ neurálních kmenových buněk
Architektura v subventrikulární zóně (SVZ)
Architektura v subgranulární zóně (SGZ)
rA – radiální astrocyty
hA – horizontální astrocyty
D – nezralá granulární buňka
G – nová granulární buňka
NSC přisedají na krevní kapiláry
- přísun živin ?
- NSC exprimují HIF.
(hypoxií indukovaný faktor)
Původ NSC
- pozůstatek neurogenní populace z časné embryogeneze
Huttner 2005
Vertikální a horizontální dělení v neurogenním epiteliu
Haydar 2002
Proporční změny v symetrii buněčného dělení mezi neurálními kmenovými buňkami (stem)
a neurálními progenitory (neurogenic, transientně se dělícími buňkami – TA)
v půběhu neurogeneze u myši
Vývoj CNS
Lui et al., 2011
Radiální glie (RG) jako embryonální NSC
Nestin+, Vimentin+, GFAP+, Sox2+, Pax6+
vRG – bipolární RG, ventrikulární zóna
oRG – unipolární radial glia-like cells,
vnější ventrikulární zóna
IP – přechodné progenitory
A) Buňky exprimující znaky/markery charaktristické pro časné progenitory (Sox2)
a neurony (NeuN a CTIP2) ve ventrikulární zóně neokortexu.
B) Dělení oRG ve vnější vertikulární zóně
C) RG/vRG dávají vznik jak vRG tak oRG, zda je vždy zachována délka radiál. fibril není známo
D) oRG produkují přechodně/transietně se dělící buňky schopné dále diferencovat
E) Diferenciace potomků oRG, ztráta exprese Sox2 a snižení aktivity Notch (snížení HES1),
zvýšení exprese TBR2
oRG na rozdíl od vRG neexprimují CD133 (Prominin), Par3 (PARD3), aPKCl , tj. součásti
apikální membrány charakteristické pro apikálně-bazálně polarizovaných buněk.
Schéma kortexu hlodavců (A) a člověka (B)
Lui et al., 2011
Stratifikace buněk v germinální zóně neurogeneze
Quiescentní NSC1 neexprimují nestin na rozdíl od aktivních NSC2
(1 aktuální SC; 2 potencionální SC)
Wang 2011
Regulace NSC
V–SVZ NSCs (dark blue), give
rise to activated B1 cells
(B1a, light blue) that actively
divide. Activated B1 cells
generate the transitamplifying
C cells (green)
which, after three rounds of
divisions, give rise to A cells,
the migrating neuroblasts.
Note that B1 cells contact
the ventricle with an apical
process. This adult VZ is also
populated by ependymal cells
E1, multiciliated cells that
together with the apical
endings of B1 cells from
pinwheel structures on the
surface. Coursing along this
ventricular surface is a rich
network of serotonergic axons
(5HT, bright green). The
basal processes of B1 cells
have endings on blood vessels.
Choline acetyltransferase
(ChAT)-positive neurons (olive
brown) found in the region
have endings in the SVZ.
Dopaminergic terminals (DAt,
purple) are also observed in
this region.
Lim 2014
Cells born in different
subregions of the adult V–
SVZ migrate along the rostral
migratory stream (RMS) into
the olfactory bulb to give rise
to unique types of
interneurons. Examples of
three types of granular cells
(GC) [green: superficial;
yellow: calretinin
(CalR)superficial; blue:
deep], three subtypes of
periglomerular cells [pink:
tyrosine hydroxylase (TH);
orange: calretinin (CalR);
purple: calbindin (CalB)] and
four novel subtypes (type 1–
4) of interneurons derived
from the most anterior V–
SVZ [27] are indicated in the
top section of the olfactory
bulb. Abbreviations: CalB,
calbindin; CalR, calretinin; TH,
tyrosine hydroxylase; PGC,
periglomerular cell; GC,
granule cell; GL, glomerular
layer; EPL, external plexiform
layer; ML, mitral cell layer;
IPL, internal plexiform layer;
GRL, granular layer.
Lim 2014
Mechanismus regulace RG buněk – Notch dráha
- neurální progenitory/IP aktivují Notch dráhu u RG buněk a tím blokují jejich diferenciaci
- Notch je dále regulován hladinou volného a s Par3 vázaného NUMB (úloha bazální membrány)
Lui et al., 2011
Regulace klíčových signálních drah komponentami
asociovanými s vazbou na bazální membránu
+ (Wnt) GSK3 signalizace
Lui et al., 2011
Dvojitá úloha Notch a gp130/STAT3 signalizace v neurogenezi
- Notch a STAT3 aktivita se vzájemně podporují
(STAT3 reguluje expresi ligandů Notch, Hes aktivuje STAT3)
- oba v závislosti na dalších faktorech a statusu buněk podporují sebeobnovu NSC
a indukci gliogeneze
- V průběhu ontogeneze intenzivní proliferace NSC (radiální glie) a TA progenitorů,
stimulováno LIF a CNTF v mozkomíšním moku, produkovaných zejména z plexus
choroideus, důležitá a dosud neobjasněná interakce s Notch drahou/signalizací.
- LIF/gp130 signalizace působí pleiotropně, u zralejších progenitorů indukuje
diferenciaci do glií, zejména astrocyty (důležitá demethylace gliálních genů),
a celkově podporuje maturaci neuronů, zejména motoneuronů.
Plexus choroideus
V průběhu embryogeneze jsou NSC tzv. radiální glie ventrikulární zóny
(vRG + oRG)
Adultní NSC jsou:
1) radiálním gliím podobné buňky, jako v průběhu embryogeneze
2) adaptované/pozměněné časné přechodné progenitory (IP)?
3) v dospělém mozku nejsou
kmenové buňky s neomezenou
schopností sebeobnovy,
existují pouze IP schopné
několika cyklů dělení
 NSCs jsou široce multipotentní a experimenty s chimérami ukázaly, že NSCs dávají
vznik buňkám všech tří zárodečných listů (netvoří pohlavní buňky, nebylo prokázáno)
 u chimér se také NSCs nepodílí na hematopoéze i přesto, že v případě likvidace
hematopoézy zářením, injikované NSCs ji obnoví (obojí děláno s myšmi ROSA26)
 na druhou stranu není jasné, zda NSCs tvoří všechny typy neronů a glií (SC x TA)
 neurální multipotentní progenitory byly izolovány i z retiny, optického nervu,
hypothalamu, čichových laloků, čichového epitelu, a míchy
 tyto směsné populace nejsou schopné dlouhodobé proliferace in vitro tak jako NSCs
a také si zachovávají některé epigenetické znaky podle místa původu
 po poškození mozku je možno neurogenezi detekovat i v striatu, neokortexu nebo
v místech kortiko-spinálních motoneuronů
 NSCs s věkem ubývá, podobně jako ostatní adultní SSCs, každopádně je lze izolovat
z mozkové tkáně i několik hodin (4-6h) po diagnóze klinické smrti
 in vitro se NSCs kultivují v podobě tzv. „neurosfér“ ve speciálních médiích určených
pro expanzi neurálních progenitorů, bez séra, ale s nadbytkem FGF2 a EGF
 LIF-gp130 / Notch blokují diferenciaci NSC, a podporují jejich proliferaci
 „neurosféry“ jsou plovoucí útvary s navýšeným množstvím neurálních progenitorů
a NSCs, lze v nich detekovat již i množství zralejších typů nervů i glií
 i neurální progenitory (TA) lze dlouhodobě kultivovat
Zobecněné vlatnosti NSCs
Příprava neurosfér, primární a sekundární neurosféry (Dirks, 2008)
Chimerická blastocysta
vytvořená po smíchání blastomer normální
a ROSA26 myši a myší embrya (11 dpc)
normální a s ROSA26 chimerické myši.
Clarke 2000
In vitro kultivace NSC – neurosféry
c) EGFR + nestin; d) BrdU + buněčná jádra
NSC jsou také schopny rekonstruovat hematopoézu (Bjornson 1999)
A – kolonie ze zdravé kostní dřeně; B,C kolonie z kostní drěně NSCs (ROSA) transplantovaných myší po ozáření;
D,E – GM-CFU z transplantovaných NSCs (ROSA); G,H - M-CFU z transplantovaných NSCs (ROSA);
D,G a E,H – bez a s X-Gal; F – granulocyty + makrofágy & I – makrofágy, stanovení May-Grunwald-Giemsa
Muller glia regenerate neurons in retina, no in adult, base in Ascl1 expression