Protokol ELISA


Metodika se sestává ze čtyř částí: 1. Stanovení koncentrace antigenu

                                                       2. Navazování antigenu na destičku

                                                       3. Optimalizace metody ELISA – jsmše
nedělali

                                                       4. Vyšetření vzorků ELISA

1.Stanovení koncentrace antigenu

            Stanovení koncentrace antigenu pomocí kalibrační křivky za použití různého ředění
albuminu. Ke stanovení koncentrace antigenu je nutné:
 1. Přichystat 5 různých koncentrací albuminu: 2 mg/ml; 1,5 mg/ml; 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,1 mg/ml.
 2. Na mikrotitrační destičce smíchat v triplikátech 5 ml vzorku s 25 μl roztoku činidel A  a 200
ml činidla B. Po cca 20 min. se změří absorbance při 700 nm.

3.      Vytvořit z hodnot albuminu kalibrační křivku a dopočítat koncentraci proteinů.


průměrné koncentrace (mg/ml)

SS

A

G

                                                                                           1,139989

                                                                                           0,484945

                                                                                           0,727945


Koncentrace antigenů kmenů B. b. sensu stricto je 1,139989 mg/ml, B. afzelii je 0,484945 mg/ml a B.
garinii je 0,727945mg/ml.

2. Postup navazování antigenu na destičku

            Po zjištění koncentrace antigenu se postupuje dalším krokem - navazováním antigenu na
destičku. S destičkou je po celou dobu nutno pracovat velmi opatrně a je nedotýkat se spodní strany
jamek.

1.       Do každé jamky mikrotitrační destičky se napipetuje 200 ml etanolu (70%). Poté je destička
přikryta víčkem a nechá se stát v klidu na vodorovné ploše při laboratorní teplotě cca 2 hodiny.

2.       Po uplynutí stanovené doby se etanol odsaje a jamky se 3x promyjí destilovanou vodou (200
ml na každou jamku). Zbytky kapaliny z jamek je třeba odstranit mírnými údery do čistého
filtračního papíru.

3.       Nyní je potřeba zředit antigen na koncentraci 2-3 mg/ml ve vazebným roztoku. Do každé
jamky se napipetuje po 100 ml takto zředěného antigenu.

4.       Takto připravená destička je v této fázi zakryta víčkem a ponechána přes noc v lednici
(při 4 °C). Nezbytné je opět zachovat její vodorovnou polohu.

5.       Druhý den je třeba odpipetovat obsah jamek a opět 3x promýt promývacím roztokem (200 ml na
jamku), oklepat a nechat oschnout.

6.       Nyní zbývá vysytit zbylou plochu na plastu, kde není navázán antigen. Do každé jamky se
napipetuje po 100 ml vazebného roztoku s rozpuštěným 3% kaseinem. (Pufr musí mít teplotu
laboratoře, aby se kasein v roztoku dokonale rozpustil.) Nyní se destička nechá stát při
laboratorní teplotě cca 2 hodiny.

7.       Odsát obsah jamek a 3x promýt 200 ml promývacího roztoku, poté je potřeba destičku opět
oklepat a nechat oschnout.

8.       Nyní jsou destičky připraveny k provedení ELISA testu. V této fázi také mohou být destičky
uloženy v lednici po dobu 2 měsíců (důležité je zabránit přístupu vlhkosti).




4. Pracovní postup ELISA

1.       Nejprve je nutné naředit vyšetřovaná séra na optimální koncentraci blokovacím roztokem. Do
blokovacího roztoku byl přidán antigen bakterií rodu Treponema - lyofilizovaná kultura Treponema
pallidum o koncentraci 0,3 μg/ml pro vyloučení křížové reakce. Zředěná séra se pipetují v množství
100 ml na jamku.

2.       Destička s naředěnými séry a dobře těsnícím víčkem se nyní vloží do termostatu a inkubuje
se při 37 °C 1 hodinu.

3.       Po uplynutí stanovené doby se destička vyjme z termostatu, roztoky v jamkách se odsají a
jednotlivé jamky se promyjí nejméně 3x promývacím roztokem (200 ml na jamku). Mírným poklepem se
odstraní zbytky kapaliny z destičky do čistého filtračního papíru.

4.       Do všech jamek se nanese po 100 ml konjugátu naředěného blokovacím roztokem a celá
destička se nechá inkubovat při 37 °C 1 hodinu.

5.       Po inkubaci v termostatu se obsahy jamek odsají, opět nejméně 3x promyjí promývacím
roztokem (200 ml na každou jamku) a celá destička se oklepe.

6.       Nyní je potřeba připravit si substrátový roztok s chromogenem a substrátem v množství 100
ml na každou jamku, a to tak, že smícháme 15 ml substrátového roztoku se 7,5 mg OPD a 7,5 ml
H[2]O[2].

7.       Destičku i s víčkem přemístíme do temna a necháme ve vodorovné pozici inkubovat při
laboratorní teplotě cca 20 min.. Během této doby se vyvíjí barva v jamkách a větší množství
především ultrafialového záření tuto barevnou reakci zintenzivňuje.

8.       Po uplynutí stanovené doby je reakce zastavena přidáním 1–2M H[2]SO[4] (50 ml na jamku).
Nejlépe ihned provádíme měření při 492 nm na ELISA-readeru.

 Výsledky ELISA – měření vzorků:

            Na každou měřenou destičku byly napipetovány v duplikátech: blank, negativní kontrola
(NK), pozitivní kontrola (PK) a konkrétní vzorky jednotlivých sér.        Pro účely grafického
znázornění výstupů z ELISA, byl od absolutní hodnoty změřené absorbance každého vzorku odečten
blank (A-B).

Je třeba vytvořit tabulku výsledků a grafy:

Grafické znázornění přepočítaných hodnot absorbance pro IgM a IgG séra:

Grafické znázornění přepočítaných hodnot absorbance pro IgM a IgG výplachů:


Závěr: Je třeba posoudit výsledky z hlediska pozitivity PK a svých vzorků z destičky.