Nukleové kyseliny
Složení
Dusíkatá báze – deriváty purinu a pyrimidinu
Sacharid - ribosa, deoxyribosa
H3PO4
Dusíkatá báze
deriváty purinu a pyrimidinu
v molekule NK se vyskytují čtyři – dvě báze „pyrimidinové“ a dvě „purinové“
DNA (adenin, guanin, cytosin, tymin) RNA (adenin, guanin, cytosin, uracil)
tautomerní formy cytosinu
enolamin
(enoltautomer aminu)
oxamin
(oxotautomer aminu)
enolimin
(enoltautomer iminu)
oximin
(oxotautomer iminu)
V těchto případech je oxoforma stabilnější než enolforma (99,9% směsi)
amínová forma stabilnější než imínová (97% směsi)
Kyslíkaté deriváty pyrimidinu a purinu existují (za fyziologických podmínek) převážně v
oxoformě a dusíkaté v aminoformě
Sacharid
pentozy – ribosa a deoxyribosa
ribosa součástí RNA, deoxyribosa součástí DNA
číslování
Nukleosidy
vazba sacharid - báze je N-glykosidická
Adenosin, guanosin
Cytidin, thymidin, uridin
+ deoxy-
Nukleotidy
Další fosforylace - anhydridy
(d)Nukleosiddifosfáty
(d)Nukleositrifosfáty
nukleotid je nukleosidmono(di,tri)fosfát (fosfátový ester na C5 pentosy)
(d)Nukleosid(mono)fosfáty
• adenosinmonofosfát – AMP
• guanosinmonofosfát – GMP
• citidinmonofosfát – CMP
• tymidinmonofosfát - TMP
• uridinmonofosfát - UMP
guanosintrifosfát
Strukturní
vzorec
Adenin
Ade
A
Guanin
Gua
G
Cytosin
Cyt
C
Uracil
Ura
U
Thymin
Thy
T
N
N
N
N
NH2
X
N
N
N
N
O
X
NH2
H
N
N
NH2
O
X
N
N
O
O
X
H
N
N
O
O
dX
H CH3
Adenosin
Ado
A
Guanosin
Guo
G
Cytidin
Cyd
C
Uridin
Urd
U
Deoxythymidin
dThd
dT
Adenylová kyselina
Adenosinmonofosfát
AMP
Guanosylová kyselina
Guanosinmonofosfát
GMP
Cytidylová kyselina
Cytidinmonofosfát
CMP
Uridylová kyselina
Uridinmonofosfát
UMP
Deoxythymidylová kyselina
Deoxythymidinmonofosfát
dTMP
Báze
(X = ribosa, 2´-deoxyribosa)
Nukleosid
(X = ribosafosfát, 2´-deoxyribosafosfát)
Nukleotid
(X = H)
Názvy a zkratky bází nukleových kyselin, nukleosidů a nukleotidů
Oligo a polynukleotidy
primární struktura
je určená sledem nukleotidových zbytků
vzniká spojováním nukleotidů fosfodiesterovou vazbou
nomenklatura
zkrácený zápis struktury
vždy od 5’ konce
ACGT
Chemické složení
Deoxyribosa x ribosa
Thymin x uracil
sekundární struktura
DNA – antiparalelní dvoušroubovice
J. Watson, F. Crick (1953) – dvojšroubovice
cesta k rozluštění sekundární struktury (DNA)
Chragaffova pravidla (poměr bazí v DNA) A = T G = C
ukázala na to, co s čím se páruje
J. Donohue – báze v tautomerních oxoformách
ukázal na to, jakými interakcemi se páruje
R. Franklinová – RTG difrakční analýza
spojování bází vodíkovými vazbami
H-můstky 2 u A-T, 3 u G-C
nezaměnitelnost bází vede ke komplementaritě vláken
Komplementarita (párování) bazí
monosacharid + fosfát lokalizace vně šroubovice – hydrofilní povrch
báze lokalizovány dovnitř - hydrofobní
dvoušroubovice má dva žlábky velký (mělký a široký) a malý (hluboký a úzký)
řetězce mají antiparalelní uspořádání
struktura DNA
struktura DNA eukaryot
nukleosom s histonem H1
histony
vysoký kladný náboj (Lys, Arg)
reverzibilní interakce s DNA (fosfát)
struktura DNA prokaryot
většina prokaryot (bakterie, archea) obsahuje jeden cirkulární
chromozom - uložen v nukleoidu
obsahují pouze jednu kopii genu (haploidní)
neesenciální geny uloženy v plasmidech mimo nukleoid
srovnání RNA x DNA
chemické složení
• thymin x uracil
• deoxyribosa x ribosa
tvar
• DNA dvoušroubovice
• RNA jedno vlákno
biologický význam
DNA „knihovna“, RNA „návod“ – odráží velikost molekuly a životnost
historie
„RNA svět“
Viry jsou vyjímka
rRNA
ribosomální – 80 %
tRNA
transferová, přenosová – 10-15 %
60 tRNA
mRNA
mediátorová, messenger
informační – 5-10 %
základní typy RNA
Relativní
zastoupení
(%)
Molekulová
hmotnost
(kD)
Počet
nukleotidů
Sedimentační
koeficient
(S)
rRNA 80 1.2 x 103 3700 23
0.5 x 103 1700 16
3.6 x 101 120 5
tRNA 15 2.5 x 101 75 4
mRNA 5 různé
RNA molekuly u E. coli
struktura rRNA a mRNA
jedno vlákno s množstvím komplementárních úseků
struktura tRNA
Typické úseky
Komplementární úseky – stabilizace
Otevřené rameno – vazba AMK
Antikodonové rameno
Variabilní – rozlišovací vlastnost pro AMK
Neobvyklé nukleotidy
Vysoká specificita
Projekce do roviny - jetelový list
Neobvyklé báze variabilního raménka
Nukleové kyseliny - vlastnosti
Denaturace a renaturace DNA
Spektrofotometrie
Sekvenace nukleových kyselin (chemická)
denaturace a renaturace DNA
zvyšování teploty – postupné rušení vodíkových můstků
nejdříve A-T pak C-G
proces je vratný (x denaturace proteinů)
využití (hybridizace, PCR, genové inženýrství … )
Spektrofotometrie
I0 – intenzita světla „vstupní“, I – intenzita světla „výstupní“, e – molární absorpční (extinkční) koeficient
c – koncentrace měřené látky, d – optická dráha
Lambert Beerův zákon
denaturace a renaturace DNA
lze sledovat spektrofotometricky - světelná absorpce vyšší u oddělených bází
na teplotu tání DNA má vliv mnoho faktorů (pH, ionty, zastoupení bází)
Určení primární struktury nukleových kyselin
Maxam-Gilbertova chemická metoda
Specifické štěpení řetězce v místě dané báze
• G – DMS, piperidin
• A+G – DMS + kys. mravenčí, piperidin
• T+C – hydrazin, piperidin
• T – hydrazin + NaCl, piperidin
• Pracná, málo efektivní, ale univerzální a nezávislá na vstupních datech
piperidin dimetylsulfát hydrazin
Odštěpení purinu vlivem dimetylsulfidu (DMS nebo DMSO)
Hydrazinolýza pyrimidinu
C reakceT reakceG reakce A reakce
Syntéza nukleových kyselin
Syntéza na pevné fázi - první monomer zakotven na nosiči
Cyklický proces (automatizace)
Deblokace reagujících skupin – vazba přes aktivované skupiny – promývání
Využití – příprava primerů, umělých genů …