Enzymová kinetika
nepřímo - aktivita - odvozena od rychlosti enzymové reakce – množství
přeměněného substrátu či vzniklého produktu za časovou jednotku. Tato
rychlost (dc/dt) se stanovuje vhodnými metodami, s výhodou fotometricky.
Jednotky aktivity
• Smluvní jednotky – např. u amylasy - množství enzymu, které
rozštěpilo za 30 min při 40 oC dané množství škrobu aby ten nedával
reakci s jodem
• IU - mezinárodní jednotky 1961 – množství enzymu, jež přeměnní 1
µmol substrátu za 1 minutu za standardních podmínek (pH, T,
přebytek substrátu, přítomnost aktivátorů)
• Katal (podle soustavy SI) 1971 - množství enzymu, jež přemění 1 mol
substrátu za 1 sekundu za standardních podmínek (pH, T, přebytek
substrátu, přítomnost aktivátorů)
1 IU = 16,67 nKat
Enzymové jednotky – vyjádření koncentrace enzymu
obsah enzymů nelze obvykle určit přímo (přebytek balastních bílkovin)
Rychlost (enzymové) reakce
Metody stanovení
Stanovení [P] nebo [S] – pak –dc/dt
Výhodnější [P], ale záleží na možnostech metody
Spektrální – absorpční, fluoresceční aj., chemické, elektrochemické
(amperometrie), enzymové (spřažené reakce)
𝒗 = 𝒅𝒄/𝒅𝒕
𝒗 = 𝒌 . [𝑺]
k - rychlostní konstanta
[S] – koncentrace substrátu
• pH – obvykle neutrální (pH 6-8 neutrofilní )
alkalofilní, acidofilní
• teplota konvenční hodnota 30oC
teplokrevní x studenokrevní, mikroorganizmy aj.
psychrofilní do 20 oC, mezofilní 20 oC - 40 oC, termofilní,
hypertermofilní (až 80 oC)
• iontová síla – obvykle odpovídá 0,9% NaCl (fyziologický roztok)
halofilní (min. 0.2 M NaCl)
• regulátory – inhibitory, aktivátory
Optimální podmínky
• In vivo – fysiologické prostředí
• In vitro – snaha o napodobení optimálních (fyziologických) podmínek
Rychlost (enzymové) reakce – vliv prostředí
Vliv pH
Tvar závislosti určuje několik vlivů
• vliv ionizace substrátu(ů)
• vliv pH na disociaci vazebných skupin enzymu (aktivní centrum)
• irreverzibilní změny struktury enzymu při extrémních hodnotách pH
pH optimum daného enzymu navíc závisí na reakčních podmínkách
(druh pufru, druh substrátu, koncentrace substrátu, přítomnost aktivátorů
a inhibitorů, doba inkubace enzymu se substrátem atd.)
Vliv teploty
„teplotní optimum“ – závisí na dalších podmínkách, doba měření aj.
dva protichůdné procesy:
zvyšování teploty zvýšení kinetické energie molekul – zvýšení počtu jejich srážek –
- zvýšení rychlosti reakce (Arheniova rovnice)
zvýšení rychlosti denaturace enzymu – pokles rychlosti reakce
𝑘 = 𝐴 . 𝑒
−𝐸𝑎
𝑅𝑇
ln 𝑘 = ln 𝐴 −
𝐸 𝑎
𝑅𝑇
Arrheniova rovnice
A - „frekvenční faktor“
Linearita – vliv koncentrace enzymu
oblast linearity je důležitá pro určení množství enzymu pro jakékoliv měření rychlosti
v0 počáteční reakční rychlost (odstranění vlivu snižující se koncentrace substrátu nebo
vlivu vznikajících produktů)
𝒗 𝟎 = 𝒌 . 𝑬
𝐸 koncentrace enzymu
využití při stanovení koncentrace enzymu
Kinetika enzymové reakce
ustavení rovnováhy [P]/[S] odpovídající
rovnovážné konstantě reakce
prestacionární stav
cca 0.01 s
Stacionární kinetika
v1 = k1.[E].[S] v2 = k2.[ES]
v3 = k3.[ES] v4 = k4.[E].[P] (= 0) platí pro podmínky v0 (počátek reakce)
Za stacionárních podmínek koncentrace [ES] konstantní v1 + v4 = v2 + v3
k1.[E].[S] + 0 = k2.[ES] + k3.[ES] = (k2 + k3).[ES]
[E].[S] / [ES] = (k2 + k3) / k1 = Km, pro k2 ›› k3 Km = Ks
v0 = k . [ES] Vlim = k. [E]t = k.([E] + [ES])
Vlim . [S]
v0 = -------------
KM + [S]
Rovnice Michaelise-Mentenové v0 = f([S])
Vlim . [S]
v0 = ----------------
Km + [S]
hyperbolický průběh
Speciální případy
[S] ◄ Km
[S] ► Km
[S] = Km v0 = Vlim / 2
Vlim
Vlim
Vlim/2
Stanovení kinetických parametrů KM a Vlim
KM + [S] KM 1 1
1/v0 = = . +
Vlim . [S] Vlim [S] Vlim
Vynesení dle Hanese a Wolfa [S] /v0 = f([S])
Lineární transformace rovnice Michaelise a Mentenové, tvar y = ax + b
Vynesení dle Lineweavera a Burka 1/v0 = f(1/[S])
Vynesení dle Eadie a a Scatcharda v0 / [S] = f(v0)
1 / [S]
1 / [vO
]
0
KmPrůsečík = -1/
VlimPrůsečík = -1/
KmSklon = / Vlim

Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / vo proti 1 / [S]
dle Lineweaver a Burka
1 / vo = Km / Vlim . 1 / [S] + 1 / Vlim
1
Km je mírou afinity substrátu k enzymu
• formálně disociační konstantou komplexu [ES]
• Není závislá na katalytickém množství (aktivitě enzymu), pokud
pracujeme v oblasti lineární závislosti v na [E]
• Lze ji tabelovat a užít jako srovnávací parametr
• Mění se s externími parametry
Liší se pro různé substráty téhož enzymu
• Alternativní
• Kosubstráty – NAD apod. (LDH)
• Vztah k metabolickým hotovostem – „pool“
Michaelisova konstanta Km
Vlim je ukazatelem aktivity enzymu
Závisí na katalytickém množství enzymu v experimentu, není konstantou
obecnějšího rázu, lze nahradit v0 při nadbytku S
Dá se užít k vyjádření katalytické účinnosti a čistoty enzymu. V těchto
případech se vypočítá tzv. specifická aktivita jako poměr Vlim a množství
enzymu (typicky v mg bílkoviny neznáme-li jeho Mr nebo pracujeme se směsí
– homogenát, krevní sérum apod.)
Specifická aktivita
• aktivita vztažená na celkové množství (koncentraci) vztažného
parametru( bílkoviny) – katal/g
• udává stupeň přečištění enzymu
Celková
bílkovina
[mg]
Celková aktivita
[nKat]
Specifická
aktivita
[nKat/mg]
Výtěžek
[%]
Přečištění
Surový cytosol 2224 941.5 0.42 100 -
Frakcionace
síranem
amonným
540.4 667.5 1.23 70.8 2.9
IEC
Sepharon Q
HR10/10
97.1 561.3 5.78 59.0 13.7
GPC
UltroPac TSKG
3000
21.5 522.0 24.28 55.4 57.8
Purifikační tabulka
purifikace alkoholdehydrogenasy bakterie Paracoccus denitrificans
Vlim / [E] [mol.s-1/mol] = TN [s-1] = kcat
Číslo přeměny (TN)
látkové množství substrátu (mol) přeměněné molem enzymu za časovou
jednotku (s) – k [s-1]
udává limitní rychlost enzymové reakce
kcat = k3 = k
Konstanta specificity
• poměr kcat (vyšší – účinnější katalýza) a Km (nižší – větší afinita enzymu k
substrátu)
• spolehlivější ukazatel substrátové specificity – preference substrátů
• modelově estery, specificita k aromatickým acylům
Inhibice enzymové aktivity
Ireversibilní
Vážou se pevně a nevratně
Lze reaktivovat chemickou reakcí
Reversibilní
interagují s enzymem vratně
dají se odstranit např. dialýzou, gelovou chromatografií
• Kompetitivní
• Nekompetitivní
• Akompetitivní
Modifikační činidla
Studium aktivního centra
Organofosfáty (sarin), ionty těžkých kovů, alkylační činidla (cystein) …
Ireversibilní inhibice
Ireverzibilní inhibice acetylcholinesterasy diisopropylfluorofosfátem
sarin
Kompetitivní
• Inhibitor se váže do aktivního místa
• Strukturní podobnost se substrátem
• Soutěžení inhibitoru se substrátem
Nekompetitivní
• Inhibitor se váže mimo vazebné místo
• Substrát neovlivní vazbu inhibitoru
Akompetitivní
• Inhibitor se váže na komplex ES
Alosterická
• Vazba na jinou podjednotku
Reversibilní inhibice
Inhibice SDH malonátem
• Jantaran (sukcinát) je substrátem enzymu sukcinátdehydrogenasy (vzniká
fumarát)
• Malonát je kompetitivním inhibitorem SDH (nelze ho dehydrogenovat)
• Strukturní podobnost, někdy bývá méně názorná (el. hustoty)
• Určení typu inhibice kineticky
Kompetitivní inhibice
Kompetitivní inhibitor
reaguje s volným enzymem a soutěží se substrátem vazné místo v aktivním
centru.
může se navázat pouze na volný enzym
V reakční směsi se vyskytuje mimo E, S a ES ještě EI (komplex enzyminhibitor),
který se tvoří vratně mezi volným enzymem a inhibitorem
Oproti neinhibované reakci zahrnuje
Ki = [E] . [I] / [EI] a pak [E]t = [E] + [EI] + [ES]
dále
v = Vlim . [S] / [Km (1+ [I]/ Ki) + [S]], kde Km (1+ [I]/ Ki) = Kapp
a po linearizaci
1/v = 1/ Vlim + Kapp/ Vlim . 1/[S]
Kompetitivní inhibitor – kinetická analýza
Výraz Kapp zdánlivá Michaelisova konstanta
Vlim se nemění
Nekompetitivní inhibitor
není podobný substrátu váže se jak na volný E tak na komplex ES
• Vytváří komplex EI
• [EI] nezávisí na [S], ale pouze [I] Et + I = EI
v = (Vlim . [S]) / (Km + [S]).(1+ [I]/Ki)
a po linearizaci
1/v = (1/ Vlim + Km/Vlim . 1/[S]) . (1+ [I]/Ki)
Nekompetitivní inhibitor – kinetická analýza
Km se nemění
Vlim se snižuje úměrně poměru [I]/Ki
Akompetitivní inhibitor
neváže se na volný enzym (pouze na komplex [ES] )
Snižuje Km i Vlim
1/v = Km/Vlim . 1/[S] + 1/ Vlim . (1+ [I]/Ki)
Pokles hodnoty Km je způsoben reakcí ES + I = ESI, která odčerpává část
komplexu ES a tím posunuje rovnováhu reakce E + S = ES doprava
Alosterické enzymy
• vazba na jinou podjednotku (oligomerní enzymy)
• kooperativita podjednotek (viz. hemoglobin)
• efektivní regulace klíčových enzymů metabolických drah
• neřídí se Michaelisovskou kinetikou
Alosterická inhibice (aktivace)
Izoenzymy
Enzymy, které katalyzují stejnou reakci, ale mají různou primární strukturu
Jsou si velmi podobné, ale dají se oddělit (např. elektroforeticky)
Klinické aspekty
Izoenzymy - laktátdehydrogenasa
Vyskytuje se ve všech tkáních (anaerobní glykolysa, cytoplasmatický enzym)
Tetramer – dva druhy podjednotek M a H
Kombinací vzniká pět izoenzymů H4, H3M, H2M2, HM3 a M4
Marker poškození určité tkáně
Zymogeny - proenzymy
proteasy – aktivace až v místě účinku
Praktické využití enzymů
Průmyslové využití
Prací prostředky (proteolytické enzymy)
Krmivářství
Potravinářství
Lékařství
Diagnostika (využití při stanovení mnoha složek klinického obrazu)
Terapie substituční (rozvoj spojený s přípravou rekombinantních proteinů)
podpůrná (tlumení negativních účinků primární léčby)
Bioanalytická chemie
Stanovení substrátů, inhibitorů
Enzymová katalýza v organické chemii
Specifita reakcí, Stereoselektivita
Extremofilní živočichové - „šampióni“
Teplota
Strain 121
hypertermofilní archebakterie z třídy Thermoprotei
nalezena v roce 2003 v hydrotermálním průduchu v Puget Sound, USA
růst při teplotách dosahujících 121 °C
metabolismus je založen na redukci oxidů železa
Cryptoendolithotrophs
mikroorganismus z Antarktidy aktivní do -15 ºC
pomáhá jim k tomu glycerol a další látky v těle
pH
Thermoplasma acidophilus
skládky hlušiny po těžbě uhlí pH 0
Natronobacterium pharaonis pH 10
Dunaliella salina
jednobuněčná zelená řasa (30 % roztok soli), Mrtvé moře (Izrael)
produkuje vysoký obsah beta-karotenu (průmyslové využití)
a glycerolu (ochrana proti osmotickému tlaku)
Iontová síla
Deinococcus radiodurans
Vydrží bez problémů dávku 5000 Gy (40% jedinců zvládne dokonce i 15 000 Gy)
žije i v blízkosti jaderných zařízení
Pro srovnání, člověk onemocní již při 2 Gy a 6 - 10 Gy se považuje za letální dávku.
Běžné bakterie nepřežijí více než 60 Gy.
Radiace
Želvuška - drobný příbuzný členovců o velikosti 0,1 – 1,5 mm
výskyt prakticky všude, včetně extrémně chladných či suchých oblastí,
nejčastěji však ve vodě nebo alespoň vlhku, například v mechu nebo v porostech lišejníků
Přežijí (v anabióze, kdy zcela vyschnou a buňky stabilizují cukrem trehalosou):
• vysoké teploty do 150°C (po dobu několika minut)
• mráz –272,8°C,
• dlouhodobé zamrznutí
• obrovské tlaky až 600MPa
• odolají i vakuu
• ozáření rentgenovými paprsky do 5700 Gy
• jsou schopny žít i sto let
• Dsup protein + kopie důležitých genů
Nejodolnější živočich
trehalosa
-D-Glc-(1 1)-b-D-Glc