04/11/2014
1
Specifické rysy
klinicko - biochemické analytiky
PREANALYTICKÁ fáze
ANALYTICKÁ fáANALYTICKÁ fáze
POSTANALYTICKÁ fáze
Analytická fáze nemůže korigovat
chyby fáze preanalytické
(G.von Boroviczeny)
Faktory neovlivnitelné
• Pohlaví
• Rasa, etnická a sociální skupina
• Věk
C kli ké ě• Cyklické změny
• Gravidita
• Biologický poločas
• Současně probíhající jiná nemoc
• Způsob stanovení referenčních hodnot
Faktory ovlivnitelné
• Fyzická aktivita před odběrem
• Psychický stres
• Dieta
3
• Kouření
• Léky
• Nadmořská výška
• Operace
04/11/2014
2
PREANALYTICKÁ fáze
• Před odběrem biologického materiálu
• Při odběru biologického materiáluPři odběru biologického materiálu
• Mezi odběrem a analýzou
biologického materiálu (transport)
ANALYTICKÁ fáze
aStandardní operační postupy (SOP)
analytické
technické
logistické
statistické
POSTANALYTICKÁ fáze
a Validace výsledků
a Výdej výsledků
a Uskladnění vzorků
a další postanalytické činnosti
04/11/2014
3
ANALYZOVANÝ MATERIÁL
B-KREV
VENÓZNÍ / ŽILNÍ (V)
ARTERIÁLNÍ (a)ARTERIÁLNÍ (a)
KAPILÁRNÍ (c)
Příklad označení: aB-pO2 , VB-Glukosa
S-krevní SÉRUM
SRÁŽLIVÁ krev
doba srážení 30min a více
(→ aktivátor srážení, gel +/-)
centrifugace 10 min, 1500x g
P-krevní PLAZMA
NESRÁŽLIVÁ krev
→ protisrážlivá činidla, gel +/HEPARIN-Li
Na NH4
Poměr krve a
antikoagulačního činidla!
Ihned po odběru: 5 – 10 x šetrně
převrátit, netřepat!
HEPARIN Li,Na,NH4,
EDTA
CITRÁT
OXALÁT
B (plná krev)
po centrifugaci – P (plazma)
04/11/2014
4
Vzhled séra / plasmy
• HEMOLYTICKÝ
• IKTERICKÝ
• CHYLÓZNÍ
U- MOČ
JEDNORÁZOVÁ
SBÍRANÁ
B- KREV
S- SÉRUM
P-PLAZMA
U- MOČ
MOZKOMÍŠNÍ MOK (likvor)MOZKOMÍŠNÍ MOK (likvor)
STOLICE
MOČOVÝ KÁMEN
VÝPOTEK
SLINY
POT
04/11/2014
5
Odběr a zacházení s
13
Odběr a zacházení s
biologickým materiálem
• Informovanost pacienta
• Režim před odběrem
Příprava pacienta před odběrem
biologického materiálu
• Načasování odběru
• Místo odběru
• Poloha při odběru
Z ů b dbě dbě é té
Odběr biologického materiálu
• Způsob odběru a odběrové systémy
• Turniket
• Odběr: Krev
Moč
Mozkomíšní mok
Stolice
Sliny, Pot, …
04/11/2014
6
Odběr krve – obecné podmínky
1 - 2 dny vynechat léky?, vitaminy, fyzickou zátěž,
vynechat tučná jídla, alkohol, omezit maso; ne po noční
směně
Ráno v 6 - 8 h , nalačno (10 – 12 h)
Před odběrem nekouřit, nepít kávu, ráno vypít 300 ml
neslazeného čaje (vody)
30 minut před venepunkcí tělesný klid v čekárně, odběr
vsedě/vleže
Turniket jen na 15 s, „nepumpovat“
Místo bez jizev, hematomů, ne strana po mastektomii
(lymfostáza) nebo s otokem
Odběr krve – obecné podmínky
Odběr musí být
anaerobní
b b blibez bublin
s dokonalým promícháním krve s přidanými činidly
činidly
Rozdíly při změně polohy
vleže - vstoje/vsedě (Guder et al.,1996)
5 -10% Ca, AST, ALP, albumin,
cholesterol, bílkoviny,…
Poloha pacienta při odběru
cholesterol, bílkoviny,…
11 – 15% Ery, hematokrit,…
16 – 50% Epinefrin,…
>50% Renin, norepinefrin,…
04/11/2014
7
ODBĚROVÉ SOUPRAVY
JEDNORÁZOVÉ
SÉRUM gel x aktivátor
srážení
PLASMA heparinNH4,Li,EDTA,NaF,
Vyplnění žádanky
Povinné údaje na laboratorní
žádance
04/11/2014
8
• Donáška
• Automobilová a jiná přeprava
• Potrubní pošta
Transport biologického materiálu
Časová odezva (TAT, turnaround time)
je doba, za kterou je k dispozici výsledek
• TAT laboratorní
• TAT celkový
Četnost preanalytických chyb
Hemolýza 40 - 70%
Nevhodný vzorek 19 46%Nevhodný vzorek 19 – 46%
Chybná identifikace 1 – 2%
(značení odběrových nádobek/zkumavek 50%,
zadávání dat do LIS 22%)
Hemolýza
in vitro > 98%
in vivo < 2%
o li ň je minimálně 40 anal tůovlivňuje minimálně 40 analytů
04/11/2014
9
Vznik hemolýzy (in vitro)
Odběr
Transport
Zacházení
Sklado ání (mimo i labo atoři)Skladování (mimo i v laboratoři)
Mechanismy působení hemolýzy
Uvolnění hemoglobinu a dalších
intracelulárních látek do séra nebo
plazmy
- zvýšení koncentrace (K, LD,…)zvýšení koncentrace (K, LD,…)
- snížení koncentrace (Glukosa, Na,…)
Chemická interference (ovlivnění CK
adenylátkinasou,…)
Spektrofotometrická interference
Klinicko-biochemická diagnostika
1. Kvalitativní analýza
2. Semikvantitativní analýza –
diagnostické proužky
3. Kvantitativní analýza
04/11/2014
10
Spektroskopické metody
- Absorpční
Fotometrie – UV/VIS (kolorimetrie) - bar. Látky, NAD(P)H
Atomová absorpční spektroskopie (AAS) – Ca, Mg, Fe, Cu,
Mg, Mn, Zn, …
- Emisní
Plamenová emisní fotometrie (PES) – Na, K, (Ca, Mg, Li),…
Potenciometrické metody
pH
Krevní plyny – pCO2, pO2
Iontově selektivní elektrody – Na, K, Ca
Elektroforetické metody – bílkoviny, isoenzymy, lipoproteiny
Imunochemické metody – bílkoviny, peptidy, hormony, TDM
Chromatografické metody – glykovaný Hb (HbA1c), léčiva,
metabolity,…
Analýza anorganických látekAnalýza anorganických látek
PES – vzorek se rozprašuje do plamene ( propan ∼ 1925 °C,
acetylen ∼ 3000 °C)
KATIONTY: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe, Zn, …
Na+ K+ Li+
AAS – řádově citlivější; Ca, Mg, Zn, Cu, Al, Fe
Na+ K+ Li+
04/11/2014
11
ISE – měří aktivitu iontů (závisí na iontové
síle, vazbě na bílkoviny a anionty)
aMe = cMe . yMe … molární
amMe = mMe . γMe … molální ρH2O (P) = 0.93 kg/kg
yMe (P) = γMe (P) . ρ (H2O)/ρH2O(P)
N +
Aktivita a vyjadřuje reálné (s termodynamickými rovnicemi
konzistentní) působení rozpuštěné složky i (iontu) odpovídající její
koncentraci korigované zahrnutím „stínících“ coulombických interakcí
á ř ý í
γNa+ (P)= 0.74
Na+vyjádřených aktivitním koeficientem γ
ai = ciγi
Při nekonečném zředění roztoku elektrolytu je γ → 1
ISE – měří aktivitu iontů (závisí na iontové
síle, vazbě na bílkoviny a anionty)
aMe = cMe . yMe … molární
amMe = mMe . γMe … molální ρH2O (P) = 0.93 kg/kg
yMe (P) = γMe (P) . ρ (H2O)/ρH2O(P)
N +
γNa+ (P)= 0.74
Na+
Na+ (128-145 mmol/l), K+ (3.0-5.2 mmol/l)
většinou kvantifikovány souběžně
1. PES
2. ISE – Na (speciální sklo), K (valinomycinová eloda)
3. fotometrické metody
a) Na+ enzymaticky
Vyvázání nadbytku Na+:
Na+ + kryptand Na+-kryptand
2-nitrofenyl-galaktosid
O
CH2OH
O
O2N
O
CH2OH
O2N
HONa
+
β-galaktosidasa
bezbarvý
žlutý
04/11/2014
12
b) K+ enzymaticky
PEP + ADP pyruvát + ATP
pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+
pyruvátkinasa
K+
O
C
H
NH
2
C
N
+
NH
2
O
C
N
HH
+ H
+
b) K+ enzymaticky
PEP + ADP pyruvát + ATP
pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+
pyruvátkinasa
K+
interference Na+ (Na-kryptand),
c) vazba do chromogenních crown-etherů (18-crown-6)
NH4+ (preinkubace s glutamátdehydrogenasou)
NH4
+ + α-ketoglutarát + NADH + H+ Glu + NAD+ + H2O
GD
Ca2+ (2.5 mmol/l)
volný
Vázaný s bílkovinami
transport plasmou na albuminu (nespecifická vazba,
12-30 Ca na molekulu Alb, kompetice mezi H+ a Ca2+),
vazba na globuliny (Alb/globuliny ~ 7/2),
vazba i s HCO3
-, laktát, citrát ..
Ca2+
-prot
1.25 mmol/l
„ionizovaný“Ca2+
1.15 mmol/l„neionizovaný“ Ca
(soli, komplexy)
0 1 mmol/l
závisí na pH !
04/11/2014
13
Stanovení Ca2+
Celkový Ca
PES, AAS
Fotometrie – tvorba barevných komplexůFotometrie tvorba barevných komplexů
(alizarin, methylthymolová modř, o-kresol-
ftaleinkomplexon)
Ca2+ + o-kresolftalein červený komplex (570 nm)
Ionizovaný Ca - ISE
Iontově selektivní membrána:
Iontoměniče – na bázi organofosfátů
(dioktylfenylfosfát)
Neutrální nosiče s vhodnými stérickými a
elektrostatickými vlastnostmi
yCa2+ = 0.29
Komplikace – koncentrace
Ca2+ závisí na pH
⇒ standardizace
na pH 7.4
Mg2+ (0.65 – 1.05 mmol/l), 71% volný, 22% Alb, 7% globuliny
Poskytuje barevné komplexy s řadou látek
Methylthymolová modř ⇒ komplex 510 a 600 nm
kalmagit ⇒ fialový komplex 532 nm
Enzymové metody (komplex Mg.ATP)
glycerolkinasa
Glycerol + Mg.ATP glycerol-3-P + Mg.ADP
glycerolkinasa
glycerol-P-oxidasa H2O2
D-glukosa + Mg.ATP D-glukosa-6-P + Mg.ADP
hexokinasa
Glukosa-6-P-dehydrogenasa NADPH
04/11/2014
14
Fe (7.16 – 28.6 μmol/l), 500 - 1600 μg/L
AAS
kolorimetrie
Fe2+ - barevné komplexy s řadou látek
bathofenantrolin, trispyridyltriazin (TPTZ), ferrozin
(3-(2-pyridyl)-5,6-bis(4-fenylsulfonát)-1,2,4-triazin)
1. Disociace Fe z transferinu (kyselé prostředí)
2 Redukce Fe3+ na Fe2+ (hydrazin hydroxylamin
Stanovení ferritinu 15 - 200 μg/L
TIBC – celková vazebná kapacita 2500 - 4000 μg/L
nepřímé stanovení transferinu
Saturace transferinu nadbytkem Fe, odstranění nadbytku
adsorbentem (ionexy, MgCO3), stanovení koncentrace
Fe v původním vzorku a po nasycení
2. Redukce Fe3+ na Fe2+ (hydrazin, hydroxylamin,
kys. thioglykolová, askorbová, siřičitan, …
3. Tvorba komplexů a fotometrie
ANIONTY: Cl- (101 – 111 mmol/l)
1. Merkurimetrická titrace
2 Cl- + Hg(NO3)2 ⇒ HgCl2 + 2 (NO3)nadbytek
Hg2+ + bisfenylkarbazon ⇒ modrý komplex
2 Coulometrická titrace (referenční metoda)2. Coulometrická titrace (referenční metoda)
titrace Ag+ vznikajících elektrolýzou Ag elektrody, měří se doba
rozpouštění elektrody do ekvivalentního bodu)
3. Fotometrické stanovení - thiokyanátová metoda
Hg(SCN)2 + 2 Cl- ⇒ HgCl2 + 2 SCN-
3 SCN- + Fe3+ ⇒ Fe(SCN)3 … červený komplex
Anorganický fosfor (0.81 –1.55 mmol/l)
H2PO4
-, HPO4
2(1:1
acidosa, 1:9 alkalosa, 1:4 pH 7.4,
100:1 pH 4.5 v moči)
1. tvorba fosfomolybdenových komplexů v kyselém
prostředí
- měřeny přímo : (NH4)3[P(Mo3O10)4] … 340 nm
- po redukci na fosfomolybdenovou modř … 600 nm
(kys. askorbová, kys. aminonaftolsulfonová, SnCl2, ..)
04/11/2014
15
2. Enzymové metody
Schulz:
fosfát glykogen
fosforylasa
glc-1-P
fosfoglukosamutasa
glc-6-P
6-P-glukonát
NADP
+
NADPH H
+
+
glc-6-P-DH
glc-6-P
Scopes:
fruktosa-1,6-bis-P
F-1,6-P-aldolasa
glyceraldehyd-3-P
ga-3-P-DH
NADH
fosfoglycerátkinasa
NAD
+
fosfát
H
+
1,3-P-glycerát 3-P-glycerát
glc-6-P glc
hexokinasa
ADP
ATPADP