Enzymová aktivita 1 Enzymová aktivita Úloha 1 25 mg laktátdehydrogenasy o specifické aktivitě 90 U.mg‐1 se  prodává za 4 266,‐ Kč. Kolik by stál 1 katal enzymu? Úloha 2 Při měření aktivity alaninaminotransferasy (ALT) byla po  zahájení reakce přídavkem 100 mm3 krevního séra do 1 cm3 reakční směsi stanovena rychlost 2,4 nmol alaninu.min‐1.  Vypočtěte katalytickou koncentraci ALT v krevním séru v  kat.dm‐3. Enzymová aktivita 2 Úloha 3 Krystalická pyruvátkinasa z králičího svalu má specifickou  aktivitu 2 kat.kg‐1. Vypočtěte molekulární aktivitu enzymu, je‐li  jeho Mr rovna 230 000. Úloha 4 Z enzymového preparátu katalasy (Mr = 225 000) o čistotě 85%  byl připraven roztok o koncentraci 2,95 mg.dm‐3. Vypočtěte  molekulární aktivitu katalasy v jednotkách s‐1, uvolní‐li 0,1 ml  roztoku z nadbytku peroxidu vodíku za 10 min 340 mm3 O2 (objem kyslíku je přepočten na normální podmínky). Úloha 5 Hydrolýza difosfátu na dvě molekuly fosfátu je u bakterie  Escherichia coli katalyzována difosfatasou o relativní molekulové  hmotnosti 120 000, složené ze 6 identických podjednotek. 1 mg  izolovaného enzymu za optimálních podmínek rozštěpil během 15  min 28 mmol difosfátu. Vypočtěte molekulární aktivitu enzymu,  aktivitu katalytického centra a dobu potřebnou k uskutečnění  jednoho katalytického cyklu. Enzymová aktivita 3 Úloha 6 Molekula enzymu sestává ze dvou identických podjednotek o  Mr = 40 000, z nichž každá nese aktivní centrum s katalytickou  aktivitou 10 s‐1. Vypočtěte čistotu enzymového preparátu v %, je‐li  jeho specifická aktivita 50 nkat.(mg proteinu)‐1. Úloha 7 1 g čerstvé tkáně (80% vody) obsahuje 0,67 µkat enzymu s  molekulární aktivitou 1000 s‐1. Vypočtěte molární koncentraci  enzymu v buňce. Veškerou vodu považujte za intracelulární. Úloha 8 V klinické biochemii má význam stanovení aktivity  aspartátaminotransferasy (AST) v krevním séru, které lze uskutečnit  optickým testem pomocí malátdehydrogenasy: aspartát + 2‐oxoglutarát → oxalacetát + glutamát oxalacetát + NADH + H+ → malát +NAD+ K reakční směsi o objemu 0,9 cm3 obsahující 0,1 cm3 testovaného  séra, 300 nmol NADH a nadbytek aspartátu a malátdehydrogenasy byl přidán nadbytek α‐oxoglutarátu v 0,1 cm3. Po krátkém lagu klesala absorbance roztoku při 340 nm v 1 cm kyvetě konstantní  rychlostí 0,04 min‐1. Je‐li absorpční koeficient NADH roven 6 220  cm2.mmol‐1, vypočtěte aktivitu AST v séru v jednotkách kat.dm‐3. Enzymová aktivita 4 Úloha 9 Bezbuněčný extrakt Penicillium chrysogenum vykazuje β‐ galaktosidasovou aktivitu, měřitelnou pomocí umělého substrátu p‐ nitrofenyl‐β‐galaktosidu. 0,25 ml extraktu obsahujícího 5 mg  proteinu v 1 ml bylo inkubováno s p‐nitrofenyl‐β‐galaktosidem  v celkovém objemu 1 ml. Po 2, 4 a 6 minutách byly odebrány vzorky  0,1 ml, přeneseny do 2,9 ml NaOH (0,1 mol.dm‐3) a v 1 cm kyvetě  změřena jejich absorbance při 400 nm odpovídající uvolněnému p‐ nitrofenolu (ε = 18 300 cm2.mmol‐1). Tímto postupem byly získány  hodnoty absorbance rovné 0,09, 0,18 a 0,27. Vypočtěte specifickou  aktivitu β‐galaktosidasy v extraktu v kat.kg‐1. Úloha 10 Při hydrolýze esteru v neutrálním pH se uvolňuje ekvivalentní  množství protonů, jež lze kvantifikovat fotometricky pomocí  vhodného indikátoru pH. Při vyhledávání hydrolas vhodných pro  biotechnologické aplikace bylo 5 μl vzorku enzymu mícháno se 100  μl reakční směsi v jamkách na mikrotitrační destičce. Výsledná směs  obsahovala 1 mM substrát (ester), 4,65 mM BES (pufr, pKa = 7,15),  0,434 mM 4‐nitrofenol (indikátor pH, protonovaná forma bezbarvá,  deprotonovaná forma žlutá, pKa = 7,2); počáteční pH činilo 7,2.  Pokles absorbance při vlnové délce 404 nm činil 0,03 min‐1.  Vypočtěte katalytickou koncentraci hydrolasy ve vzorku (v kat.dm‐3),  je‐li rozdíl absorpčních koeficientů deprotonované a protonované formy indikátoru 17 300 M‐1.cm‐1 a délka optické dráhy 0,3 cm. Úloha 11 Excitační a emisní fluorescenční spektra volného 7‐amino‐4‐ methylkumarinu (AMC) jsou posunuta k delším vlnovým délkám  oproti spektrům AMC navázaného amidovou vazbou na peptid. Lze  proto zvolit takovou excitační vlnovou délku, při které fluoreskuje  pouze volný a nikoli vázaný AMC. Toho se využívá při  fluorimetrickém měření aktivit peptidas. Při měření byla citlivost  fluorimetru předem nastavena tak, aby fluorescence vzorku 2 cm3 1  μM AMC odpovídala 100. Po nastartování reakce v 2 cm3 reakční  směsi fluorescence vzrostla za 1 min o 20. Jaká je aktivita peptidasy přítomné v kyvetě (v jednotkách kat)? Enzymová aktivita 5 Úloha 12 Při oxygrafickém stanovení aktivity aktivity enzymu redukujícího  kyslík byly do nádobky oxygrafu obsahující 2 ml reakční směsi  přidány 2 µl preparátu o koncentraci proteinu 5 mg.ml‐1. V  důsledku toho poklesl během 1 min obsah kyslíku v nádobce o  32%. Vypočtěte specifickou aktivitu enzymu v kat.kg‐1, má‐li  nasycený roztok kyslíku v médiu (odpovídající parciálnímu tlaku  kyslíku ve vzduchu) koncentraci 2,4.10‐4 mol.l‐1. Jak by se dalo  experimentálně zjistit, je‐li produktem redukce kyslíku voda nebo  peroxid vodíku? Úloha 13 pH‐statu bylo použito k měření aktivity hydrogenasy, která redukuje  protony (H+) na molekulový vodík (H2). Jako zdroj elektronů sloužil  redoxní mediátor methylviologen (MV): 2H+ + 2MVred → H2 + 2MVox Redukovaná forma MVred se kontinuálně obnovovala redukcí  oxidované formy MVox dithioničitanem: 2MVox + S2O4 2‐ + 2H2O →  2MVred + 2HSO3 ‐ + 2H+ Vznikající hydrogensiřičitan částečně disocioval (pKa = 7,2) HSO3 ‐ ↔ SO3 2‐ + H+ Určete hydrogenasovou aktivitu (mol H2.s‐1) v nádobce, je‐li při pH =  6,8 spotřeba 1 nmol NaOH.s‐1. Úloha 14 Odhadněte intracelulární koncentrace enzymů na základě  následujících zjednodušujících předpokladů: ‐ čerstvá tkáň obsahuje pouze intracelulární vodu, která tvoří 80%  její hmotnosti, ‐ obsah proteinu činí 15%, ‐ všechny rozpustné proteiny jsou enzymy, ‐ jejich průměrná relativní molekulová hmotnost je rovna 150000, ‐ v buňce je přítomno tisíc různých druhů enzymů ve stejných  koncentracích. Enzymová aktivita 6 Úloha 15 Chorismátmutasa/prefenátdehydrogenasa (EC 5.4.99.5/1.3.1.12)  je bifunkční enzym katalyzující dva následné kroky v biosyntéze  tyrosinu. Enzym izolovaný z Escherichia coli K12 představuje  homodimer o relativní molekulové hmotnosti 78000. Jeho  intracelulární koncentrace, která obvykle činí asi 2,5.10‐7 mol dm‐3,  je osmdesátinásobně zvýšena u regulační mutanty JP 2319. Buňku  E. coli lze aproximovat válcem s průměrem podstavy 0,8 μm a  výškou 2 μm. Při kultivaci E. coli JP 2319 se z 1 dm3 kultivačního media získá asi  2.1012 buněk. Určete, kolik dm3 media je zapotřebí zpracovat k  izolaci 50 mg enzymu, poskytuje‐li používaný purifikační postup 26  % výtěžku enzymové aktivity. Úloha 16 Ceruloplasmin (ferroxidasa) je plazmatická bílkovina tvořená v  játrech, která se účastní transportu mědi; má však i  oxidoreduktasovou aktivitu. Po purifikaci ceruluplasminu z krevní  plazmy (3,5 l, koncentrace proteinu 80 mg.ml‐1) byla získána  frakce o objemu 0,18 l (koncentrace proteinu 0,6 mg.ml‐1).  Vypočtěte stupeň přečištění a výtěžek ceruloplasminu, byla‐li  v 1 ml výchozí plasmy přítomna p‐fenylendiaminoxidasová aktivita 0,246 nkat, kdežto aktivita 0,05 ml finální frakce činila  0,157 nkat. Úloha 17 Extrakt z lidské placenty má schopnost oxidovat různé diaminy (např. kadaverin) i  monoaminy (např. histamin). Purifikace příslušného enzymu probíhala v následujících  krocích: (1) Z 9620 cm3 extraktu byl síranem amonným vysrážen protein do 65% nasycení a  sediment byl rozpuštěn v 3000 cm3 pufru. (2) Srážení síranem amonným bylo opakováno (35 ‐ 65% nasycení), sediment byl rozpuštěn  v 223 cm3 pufru. (3) Roztok enzymu získaný v 2) byl chromatografován na koloně s DEAE celulosou; aktivní  frakce byla obsažena v 344 cm3 eluátu. (4) Předchozí frakce byla chromatografována na fosfocelulose; aktivní frakce eluátu měla  objem 440 cm3. (5) Po zahuštění pomocí polyethylenglykolu byl enzymový preparát podroben gelové  filtraci na Sephadexu G‐200; aktivní frakce byla obsažena ve 130 cm3 eluátu. Ve výchozím extraktu i jednotlivých frakcích během preparace byly stanoveny enzymové  aktivity s kadaverinem resp. histaminem jako substráty (udávané konvenční jednotky se  vztahují k použité spektrofotometrické metodě měření). Ke srovnání koncentrací proteinu  v jednotlivých frakcích sloužily hodnoty absorbance při vlnové délce 280 nm (A280). Enzymová aktivita 7 frakce výchozí 1 2 3 4 5 A280 12 17,8 47,6 11,5 1,06 1,16 aktivita, jednotky v 1 cm3 kadaverin 4,8 11.9 971 356 105 364 aktivita, jednotky v 1 cm3 histamin 4,75 6,8 155,4 81,9 22 76,5 Diskutujte průběhy specifických a celkových aktivit při purifikaci. Jaké lze určit závěry o  počtu přítomných enzymů a jejich substrátové specifitě? Úloha 17‐ pokračování