Protein-proteinové interakce • stabilní (velké plochy, většinou součástí komplexů) • přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání signálů, modifikace) • posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO) • souhrn proteinových interakcí = interaktom (modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén - různé „(re-)wiring“ komplexů) interaktom komplex … kvarterní struktura Sergeant et al.: MCB, 2005 - více povrchů jednoho proteinu interaguje s více partnery - vzájemné interakce více proteinů vytváří větší povrchy a vzájemně se stabilizují – vzniká pevný (kvarterní) komplex Nse4 Baderetal,FEBSLett,2008 modulace interakcí – inhibice (virovými proteiny, mutacemi) vs nové interakce Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů ) Síť neznamená komplex (hůře popisuje stabilní komplexy, ale lépe popisuje vztahy) KITEs dimerize via WHA NSE1 NSE1 NSE4 NSE4 -L,-T,-H -L,-T vect WT L264F P209L patients L97A F266A NSE3 L264F P209L WT WT NSE3 NSE3 van Crabben et al, J Clin Invest, 2016 mutace destabilizuje celý SMC5/6 komplex mutace v buňkách pacienta naruší Nse3-Nse4 interakci Síť neznamená komplex (hůře popisuje stabilní komplexy, ale lépe popisuje vztahy) Interaktom x komplexom Wang et al., Nature, 2004 transkripce MAPK - PPI „přiblíží“ proteiny vs difuze - koordinované předávání signálů, substrátů … - ligandy, PTM … modulují PPI … procesy Regulace/modulace interakcí    k kk kkkk kkk scaf kkk k G-proteiny () disociují a následně interagují ( se scafold proteinem Ste5 … Fus3 relokalizuje do jádra a aktivuje Ste12 Replikace DNA (video): DNA helikasa (modrá) “denaturuje” dvoušroubovici– připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové) spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován (RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty). Dynamika komplexů - PPI DNAi_replication_vo2-lg Kelch et al, BMC Biol, 2012 Citace, popis Kelch et al, BMC Biol, 2012 Kelch et al, Science, 2011ATP modulace - clamp loader ATP ADP Aktivovaný (ATP) clamp loader interaguje s PCNA a otevírá ji pro DNA. Vazba DNA stimuluje hydrolýzu ATP a uvolnění clamp loader (uzavřeného s DNA). PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1 Zheng a Shen, J Mol Cell Biol, 2011 Gao a spol, Mol Cell, 2012 po skončení syntézy „lagging strand“ metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) nahradí polymerásy a vyštěpí RNA primer (demetylace a fosforylace disocuje Fen1) - … degradace poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí cukrfosfátovou kostru Posttranslační (PTM) modifikace modulují složení komplexu PCNA – regulace buněčného cyklu p21 blokuje přístup polymerás – zastaví se replikace a buněčný cyklus v S fázi p21 je upregulován nádorovým supresorem p53 (v případě poškození DNA …) Magaetal,FASEBJ,2004 p21 interaguje s PCNA podobným způsobem jako polymerasy (kompetuje) Freudenthal et al, NSMB, 2010 pokud je DNA poškozená, pol se zastaví a je třeba poškození nejdříve opravit – jednou z možností je „zastoupení“ jinou polymerásou, která poškozené místo „toleruje“ a překopíruje (translesion synthesis) – přepíná se ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) TLS polymerasy () obsahují PIP a UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA Bergink & Jentsch, Nature, 2009 Sale et al, JCS, 2012 Oprava DNA: PCNA-ptm TLS polymerasy ( obsahují UBM (správně přečtou chybu a zařadí správnou bázi) Srs2 (antirekombinása) obsahuje SIM (nedovolí rekombinaci v průběhu replikace) Template switch K63 polyUb PCNA asociuje s CAF1 (chromatin assambly factor) a pomáhá znovunavázání histonů (nukleosomů) a vzniku chromatinu Dohke et al, Genes to Cells, 2008 Ransom et al, Cell, 2010 PCNA je “swiss-army knife” (PCNA je „core – jádro“ komplexů) PCNA – moduly PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“ tj. s mnoha funkčními moduly - Loading - Sliding - Terminace - Buněčný cyklus - TLS a oprava DNA - Chromatinizace … 2 Gavin et al., Nature, 2006 Gavin et al., Nature, 2006; Krogan et al, Nature, 2006 Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae 2 Liljas a spol. ATPasová pumpa komplex se stálým složením/poměrem podjednotek („neměnný“) Stabilní komplex – molekulární stroj 14.4-ATP_synthase Iino et al., CO in SB, 2015 PDB: 1C17:Apumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu Rastogi & Girvin, Nature, 1999 pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli). Dochází k neutralizaci náboje – otočka. „ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to dvojitý molekulární motor – „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie). Molekula měsíce v prosinci 2005 Rastogi & Girvin, Nature, 1999 F0 je protonový rotor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu. Tento rotor je spojen s druhým F1 chemickým motorem poháněným ATP (nebo vyrábějícím ATP). Oba rotory jsou spojeny statorem. Pouze některé části byly vykrystalizovány (zbylé části doplněny dle EM) Při otočce osa tlačí na F1 motor (3 různé konformace) – levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP - pravý panel = ATP molekula byla vytlačena Iino et al., CO in SB, 2015 Mulkidjanian et al, NRM, 2007 mitochondriální vakuolární Burkinshaw et al, BBA, 2014 Type III secretion systém (T3SS - injectisome) – bakteriální patogeny injikují (efektorové) proteiny skrze „jehlu“ do hostitelské buňky – ATPasová část pomáhá „protlačit“ efektorové proteiny z patogení bakterie skrze „jehlu“ do hostitelské buňky Mulkidjanian et al, NRM, 2007 - ATPasové pumpy … - sekreční systém (T3SS injectisom) - pohon bičíků … Více CG030 •Cytoskeletalní motory • Myosin – svalová kontrakce, transport váčků • Kinesin - transport váčků po mikrotubulech od jádra • Dynein - transport váčků po mikrotubulech k jádru, pohyb bičíků •Rotační motory: • FoF1-ATP syntása/ATPasa – přeměna energie ATP na elektrochemický potenciál nebo naopak (mitochondrie) – pumpování protonů přes membránu (vakuoly) • rotace bakteriálních bičíků •Motory nukleových kyselin: • RNA polymerase – přepisuje DNA do RNA • DNA polymerase – syntetizuje druhý řetězec na ssDNA • Helicases – odděluje řetězce DNA (transkripce, replikace …) • Topoisomerases - redukce supercoiling DNA • RSC a SWI/SNF komplexy remodelují chromatin • SMC proteins – zodpovědné za vytváření smyček na chromatinu Molekulární motory – evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací a novou kombinací podjednotek/modulů) Proč skládat komplexy z menších podjednotek? – evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací a novou kombinací podjednotek/modulů) – komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější … – skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) – skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) – velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší je méně stabilní a hůře se skládá) – menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen => méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám – odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury) Proč skládat komplexy z menších podjednotek? Kde najít více proteinových komplexů = PDB Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů voda, ATP ATP pumpa mikrotubuly chromatin proteasom Příklady komplexů chaperon apoptosom ATP pumpa Více CG030 Shrnutí • Proteiny mohou být součástí jednoho (stabilní) nebo více komplexů (dynamické/modulární) • Dynamické/modulární komplexy (PCNA) – množství podjednotky determinuje složení komplexu – Interakce/složení podjednotek dynamických komplexů jsou modulovány např. posttranslačními modifikacemi • Stabilní komplexy (ATPasová pumpa) – podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost) – stabilní komplexy disociují proteolyticky – pokles hladiny jednoho proteinu má za následek pokles hladiny ostatních podjednotek CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů CG031 – Cvičení z modelování proteinových komplexů jarní semestr - doc. Jan Paleček Kvíz – zapište komplexy či „molekulární stroje“, které jste zahlédli během videoprojekce Molecular machinery of life: https://www.youtube.com/watch?v=FJ4N0iSeR8U Test 1• testy předat příště přednášejícímu • 1. Jaké typy AMK se nejčastěji podílejí na protein-proteinových interakcích? • a. polární • b. nabité • c. hydrofobní • d. aromatické • • 2. Jaké sekundární struktury se podílí na coiled-coil vazbě? • a. beta-listy • b. beta-listy a šroubovice • c. smyčky • d. vzájemně se obtáčející šroubovice • • 3. interaktom je: • a. interakční síť proteinů (pro daný organismus) • b. soubor všech interakcí jednoho proteinu • c. databáze všech interakcí biomakromolekul • d. interakce podílející se na vzniku komplexů • 4. Jaké charakteristiky musí splňovat povrchy vzájemně interagujících proteinů? • a. stačí, když mají opačné náboje • b. stačí, když mají komplementární tvary • c. musí mít komplementární charakter (tvar, polaritu) • d. stačí, když jsou hydrofobní • 5. napište aspoň 2 příklady proteinů s coiled-coil doménou: Test 2• testy předat příště přednášejícímu • 6. Co je to komplexom? • a. interakční síť proteinů v buňce • b. soubor všech interakcí jednoho proteinu • c. soubor proteinových komplexů v buňce • d. síť silných interakcí • 7. Jak může post-translační modifikace proteinu přímým způsobem ovlivnit protein-proteinovou interakci? • a. nemůže ji ovlivnit • b. ovlivní pouze konformaci proteinu • c. blokuje nebo posílí vazbu • d. degraduje protein • 8. Jaké hlavní výhody skýtá proteinový komplex složený z podjednotek (oproti stejně velké makromolekule obsahující pouze jeden protein)? • a. lepší dynamika, modularita, regulace • b. větší stabilita proteinů • c. lepší přístup k proteinům • d. účinnější převod regulačních signálů • 9. Jak pracuje mitochondriální ATP pumpa při konverzi ADP na ATP? • a. transportuje přes membránu Na+ • b. využívá molekulu cGMP • c. transportuje K+ přes membránu • d. generuje rotační pohyb při transportu H+ přes membránu • 10. napište aspoň 3 příklady molekulárních strojů: • • •