Počítání krevních buňek Principy hematologických analyzátorů Bourková L., OKH FN Brno Hematologické analyzátory •každý má svá jedinečná specifika •dva základní principy měření: –optický –impedanční •z měření získáváme informace o: –počtu buněk (kvantitativní analýza) –velikosti, tvaru a složení buňky (kvalitativní analýza) •principy měření mohou být na jednotlivých analyzátorech různě kombinovány •různé kombinace pak umožňují různě přesnou kvantitativní i kvalitativní analýzu všech prošlých buněčných elementů Principy měření •absorbční spektrofotometrie •impedanční analýza •optická analýza • •Poznámka: dle typu analyzátoru lze počítat i více jak 10.000 buněk Používaná diagnostika •analýza nesrážlivé periferní krve –odběr krve do solí EDTA (K, Na) •ředící roztoky –impedanční analýza vodivý roztok + nevodivá buňka –optická analýza opticky inaktivní roztok + opticky aktivní buňka •lyzační roztoky hemolýza erytrocytů a dle typu analyzátoru může být i destrukce jiných krevních elementů •barvící roztoky barvení obsahu buňky (granula/enzymy, DNA, RNA) •čistící roztoky čištění měřícího systému Absorbční spektrofotometrie •Metoda slouží ke stanovování množství hemoglobinu ve vzorku (cca. λ = 540 nm) (bezkyanidové metody) Impedanční analýza - I •mezi elektrodami je v apertuře standardní vodivost (vodivost zajišťuje diluentu) •buňky jsou v jedné kyvetě suspendovány diluentem (s katodou) → pomocí vakua jsou nasávány malým otvorem (aperturou) do druhé kyvetky s diluentem (s anodou) •obě kyvety jsou přes aperturu propojeny vodivým diluentem •při průchodu buňky aperturou se vodivost naruší/změní: vzniká impedanční impulz •četnost impulzu ® počet buněk velikost impulzu ® velikost buňky Impedanční analýza - II •měření může být doplněno vysokofrekvenční analýzou: –na stejnosměrné elektrické pole –je superponováno vysokofrekvenční elektrické pole –to pronikne cytoplazmou –pak se změří vysokofrekvenční vodivost buňky –ta odpovídá její fyzikálněchemické struktuře (kvalitativní analýza buňky) Hydrodynamická fokusace •využívá unášení jednotlivých buněk proudem kapaliny •pro optickou analýzu Optická analýza •využívá se průtoková cytometrie: (spolu s hydrodynamickou fokusací) –každá buňka je ozářena monochromatickým laserovým paprskem –po interakci buňky s paprskem se provádí analýza –analyzuje se samostatně každá buňka v suspenzi •detekuje se světlo: –prošlé –odražené –depolarizované –fluorescence https://www.abbottdiagnostics.com/sal/image/MAPSS_differentiation_classification.png Laser → Detekce optické analýzy •Analýza prošlého světla •Detekce paprsku ve směru 0° udává hodnoty: –počet prošlých buněk –velikosti jednotlivých buněk •Analýza odraženého a depolarizovaného světla •Detekce paprsků v různých úhlech (dle typu analyzátoru). •Analýza může být doplněna cytochemickým barvením buněk. –Roztok se substrátem (např. 4-chlor-1-naftol) barví v leukocytech enzym peroxidázu. •Reakcí enzymu se substrátem vznikají v buňce barevné intracelulární sraženiny, které ovlivňují úbytek světla a rozptyl paprsku. •Měření slouží k detekci tvaru a velikosti buňky, jádra a granularity cytoplazmy Analýza fluorescence •Obarvení buňky speciálními barvami → ozáření buňky laserovým paprskem. •Absorbce světla buňkou → emise světla o vyšší vlnové délce → detekce emitovaného světla •Detekce: DNA, RNA nebo povrchové antigeny (CD znaky).