Kalibrace, kontroly kvality v
koagulační laboratoři
Kalibrační materiál
Komerční kalibrační plazmy
 přesně udaná hladina vyšetřované složky
 naváznost na mezinárodní referenční
materiály
 některé parametry návaznost na „pool“
normální plazmu (aPTT, PT,..)
Směsná normální plazma (PT, aPTT)
Kalibrace1/ Vyšetření
 Různých ředění kalibrační plazmy s udanou hladinou
parametru(100%, 50 %, 25 %….)
 Několika kalibračních materiálů s různou hladinou
parametru
 a vynesení naměřených hodnot (čas, A…) pro jednotlivé
hladiny do grafu
 Závislost lin/lin, lin/log, log/log,nelineární(polynom)
2/ Vyšetření referenčního času (času normálu) pro výpočet
R, INR
3/ Načtení kalibrace čarovým kodem u předkalibrovaných
metod
Ředění kalibrační plazmy
Automatické
 naprogramováno
Manuální
Typy ředění
Geometrickou řadou
100 % 100 % plazma (neředěná/ředěná)
50 % 1 díl 100% plazmy + 1 díl pufru
25 % 1 díl 50 % plazmy + 1 díl pufru
12,5 % 1 díl 25 % plazmy + 1 díl pufru
6,25 % 1 díl 12,5 % plazmy + 1 díl pufru
Typy ředění
Jiný způsob
1:1 100 % plazma (neředěná/ředěná) 100%
1:2 1díl 100% plazmy + 1 díl pufru 50 %
1:4 1díl 100 % plazmy + 3 díly pufru 25 %
1:8 1díl 100 % plazmy + 7 dílů pufru 12,5 %
1:16 1díl 100 % plazmy + 15 dílů pufru 6,25 %
Kalibrační křivka
Grafická závislost měřeného parametru na hladině
vyšetřované složky
měřený parametr (osa y)
 koagulační čas (s)
 absorbance (A, ΔA/min)…..
hladina vyšetřované složky (osa x)
 aktivita (%, IU/ml…)
 koncentrace (g/l, g/ml…)
Kalibrační křivka - požadavky
minimálně tříbodová
závisí na typu vyšetření
musí pokrýt rozsah normálních i patologických
hodnot
linearita kalibrační křivky (ideální r = 1,00)
pokud naměřená hodnota mimo kalibrovanou
oblast v oblasti s klinickým významem je
nezbytné opakovat vyšetření s jiným ředěním
(menším nebo větším) vyšetřované plazmy
Odečtení výsledku
Automatické
Manuální
přímé odečtení
 stejné ředění kalibrační i vyšetřované plazmy
odečtení + vynásobení dilučním faktorem
 odlišné ředění kalibrační a vyšetřované plazmy
Provedení kalibrace
při změně šarže setu
při změně šarže jednotlivých reagencií, v
případě že nejsou součástí jednoho setu
po kalibraci musí následovat provedení kontrol
kvality s deklarovaným rozmezím v normálním i
patologickém rozsahu
Kalibrace rutinních koagulačních
vyšetření PT, APTT, Fbg, AT, D-DI,aXa
Kalibrační materiál
 komerční kalibrační plazmy
 směsná normální plazma (PT, aPTT)
Provedení kalibrace
 při změně šarže setu
 při změně šarže jednotlivých reagencií,
 v případě, že nejsou součástí jednoho setu
Kalibrace speciálních koagulačních
vyšetření
Kalibrační materiál
 komerční kalibrační plazmy
Provedení kalibrace
 s každou sérií vyšetření vzhledem k omezené
stabilitě reagencií a vysoké citlivosti
 za obzvláště citlivé metody vyžadující kalibraci s
každou sérií jsou považována vyšetření FF VIII,
IX, XI a XII, PC a PS
Typy kontrol
Preciznost v čase (mezilehlá preciznost,
reprodukovatelnost)
Kontroly s deklarovaným rozmezím
Porovnatelnost přístrojů/metod
Preciznost v sérii (opakovatelnost)
Pravdivost (správnost)
Požadavky na kontrolní vzorky
 Měření v jednom běhu současně se vzorky pacientů
 Analyzované složky musí být dostatečně stabilní,
složení co nejvíce podobné vyšetřovaným vzorkům
 Zcela nezávislé na kalibračních materiálech,nesmí
být použity ke kalibraci analytických metod
 Nutno použít více kontrolních vzorků s různou
hladinou měřeného parametru, aby byl pokryt celý
měřený rozsah
 Odlišné hladiny nelze získat různým ředěním téhož
kontrolního materiálu!!!
Kontrolní materiál
 Firemní komerční materiál (lyofilizované)
 referenční materiál (cílová hodnota, návaznost)
 materiál s deklarovaným rozmezím hodnot
 atestovaná kontrola
 materiál bez deklarovaného rozmezí hodnot
 neatestovaná kontrola
 V laboratoři připravený kontrolní materiál
 šokově zmrazený nebo čerstvý
 Kontrolní materiály v rozmezí
 fyziologických i patologických hodnot („normální“ a
patologické)
Preciznost
je těsnost shody mezi navzájem nezávislými
výsledky opakovaných měření téhož vzorku
číselným vyjádřením = směrodatná
odchylka(SD) od aritmet. průměru (x)
(xi - x)2 (xi - x)2
SD =  --------------- nebo SD =  ---------------
n-1 n
Preciznost
relativní směrodatná odchylka = variační
koeficient (CV)
SD x 100
CV = ----------- (%)
x
Stanovení preciznosti
Opakovaná analýza stejného kontrolního
materiálu, který nemusí mít udaný obsah
stanovovaných složek (neatestovaný kontrolní
materiál)
 zajištění dostatečného množství kontrolních
vzorků
 zajištění stability vyšetřovaných parametrů
Stanovení preciznosti
Preciznost metody v sérii
 je to souhlas mezi výsledky opakované analýzy
téhož kontrolního vzorku, analyzovaných
opakovaně (např. 10x) stejnou metodou ve
stejném čase
Preciznost metody v čase
 liší se od přesnosti v sérii tím, že se kontrolní
vzorek analyzuje každý den v provozních
podmínkách současně s ostatními vzorky
Preciznost v čase/reprodukovatelnost
Rutinní koagulace (PT,APTT,Fbg,TT,AT,D-Di,aXa)
 Kontrolní materiál
 komerční (neatestovaný)
 připravený laboratoří
 Dvě hladiny (N a P)
 Provádět minimálně 1-2x denně
 před zahájením denního provozu (a před pohotovostní
službou), pro každý parametr a pro každý přístroj, který
je v provozu
Speciální koagulace
 jen u vyšetření prováděných s větší frekvencí
Preciznost v čase - vyhodnocení
Statistické programy
 koagulační automat
 LIS
 samostatné
 výstup na Levey - Jenninsonovy grafy
Westgardova pravidla
 není běžné
Preciznost v čase - vyhodnocení
Nutno provádět průběžně
 průměr, SD, CV (CV/SD doporučené nebo
vlastní)
 kontrolní rozmezí (průměr ± 2 SD)
 varovné rozmezí maxim.(průměr ± 3 SD)
Kontroly preciznosti pro AT - N
54,4
69,4
84,4
99,4
114,4
129,4
144,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Kontroly preciznosti AT - P
15,1
31,7
48,3
64,9
81,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Preciznost v čase - vyhodnocení
Pokud výsledek mimo povolené meze
 musí se najít příčina a celou sérii včetně kontrol
zopakovat
Pokud výsledky na jedné straně od x nebo
vykazují stoupající nebo klesající trend, velký
rozdíl oproti předchozímu výsledku...
 je nutno analytickou metodu opravit
Preciznost v čase/reprodukovatelnost
Vedení protokolů
 průběžně
 výsledky měření, kontrolní a varovné rozmezí,
CV / SD autorizace, schválení
 závěr (šarže kontroly, reagencie, kalibrace)
 CV / SD, (počet překročení kontrolního rozmezí)
Primární dokumentace
 tisk výsledků kontrol, grafů
Kontroly s deklarovaným rozmezím
Atestovaný komerční kontrolní materiál
Použít minimálně dva nezávislé kontrolní vzorky
 normální
 patologický
Odchylky/rozmezí uvedené na kontrolních
materiálech nesmí být překročeny
Pokud k tomu dojde, je nutné hledat příčinu a a
celý běh analýz včetně analýzy kontrolního
vzorku zopakovat
Kontroly s deklarovaným rozmezím
Rutinní koagulace
 při změně šarže reagencie
 po kalibraci
 1x měsíčně minimálně
Speciální koagulace
 po kalibraci
 s každou sérií vyšetření
Kontroly s deklarovaným rozmezím
Vyhodnocení
 porovnání s deklarovanými hodnotami
Vedení protokolů
 výsledky měření
 deklarované rozmezí
 autorizace
 schválení
Preciznost v sérii /opakovatelnost
Nepatří mezi běžné kontroly v koagulaci
Provádí se
 při validaci přístroje
 pro ověření správné funkce přístroje
 při zavádění nových metod
Počet měření 6 – 10
Vyhodnocení
 průměr, CV / SD ( doporučené)
Porovnatelnost přístrojů
Rutinní koagulace (PT,APTT,Fbg, TT,AT,D-Di,aXa)
 Vzorky pacientů čerstvé (N a P)
 1x denně na všech přístrojích, které v provozu
 Komerční atestované kontroly (N a P)
 po kalibraci a při změně šarže reagencie
Speciální koagulace – běžně se neprovádí
Vyhodnocení
 D% (procentuální odchylka výsledků měření
analýzátorů vůči referenčnímu analyzátoru)
 D% = (v - AV/AV) x 100
 v = výsledek měření analyzátoru
 AV = vztažná hodnota referenčního analyzátoru
Pravdivost
Je těsnost shody mezi průměrnou hodnotou
výsledků více měření a uvedenou cílovou
hodnotou referenčního kontrolního materiálu
 min.6 měření za podmínek opakovatelnosti
Vyhodnocení
 Bias% (odchylka aritmetického průměru série
výsledků měření od cílové hodnoty kontroly
 bias% = (x - AV/AV) x 100
 x = aritmetický průměr výsledků měření
 AV = vztažná hodnota referenčního materiálu