Principy vyšetření hemostázy, preanalýza
FN BRNO
Trombóza - Hemostáza - Krvácení
Fyziologie krevního srážení
Základní homeostatický mechanizmus
Spolupůsobení různých systémů včetně regulačních zpětných vazeb
^ Cévní stěny
Trombocytů
Plazmatické koagulační faktory ^ Plazmatické inhibitory ^ Systém fibrinolytický
Dělení testů
Testy globální ^ postihují celý systém (i více)
Testy skupinové (screening)
^ postihují určitou část koagulačního systému
umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu
Testy speciální ^ vyšetřují jednotlivé složky systémů
Dělení testů dle principu
■^Koagulační Fotometrické Imunochemické
Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické)
Sledování času rozpuštění koagula Sledování rozpustnosti koagula Jiné
Dělení testů dle principu
-^Koagulační
^1 sledování času srážení (srážlivá plná krev)
bez přídavku aktivátoru/aktivovaná doba srážení (ACT)
• manuálně (kývání)
• POCT (přenosné přístroje point of care)
^1 sledování času vytvoření fibrinového vlákna (plazma)
manuálně (háčkování) koagulometr (poloautomat, automat)
• mechanické
• kuličkové (sledování změn pohybu kuličky)
• háčkové
• optické
• nefelometrie (sledování rozptylu světla)
• turbidimetrie (sledování průchodnosti světla)
Dělení testů dle principu
Fotometrické
^1 sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A)
end point" (A) kinetické (AA/min)
^ limitace -hemolytické a ikterické vzorky
-^Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) ^1 sledování změn zakalení
detekce změn transmise (propustnosti T) detekce změn absorbance limitace- chylózní vzorky
Chromogeny
Chromogenní substrát
^ uměle připravený
velkoobjemová     aminokyselinové bezbarvý koncovka      raménko zakončené paranitroanilid
Argininem
Chromogeny
Princip
enzymy štěpí substrát - vzniká žluté zbarvení ^ měříme při 405 nm
Kinetické měření
1 min
čas měření (min)
Dělení testů dle principu
Imunochemické
sledovaní reakce antigénu s protilátkou
• aglutinace
• LIA
• EL1SA
• EID
Aglutinačni metody
sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
odečítání makroskopicky a pozitivní( +, ++, +++)/negativní semikvantitativní metody (udaná mez detekce) metody
latexaglutinační (např. FDP, D-Di) hemaglutinační (např. FM)
Příklad vyšetření D-Dimerů
Mez detekce = 0,5 mg/l	neředěný vzorek	vzorek ředěný 1:6	výsledek
aglutinace			< 0,5 mg/l
aglutinace	+		> 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l
aglutinace	+	+	> 3,0 mg/l
Liquid immunoassay - LIA metody
Sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
Odečítání optickým systémem koagulometru
Změna zakalení (AA/min) Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...)
Limitace ^ Chylozita vzorku
^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem)
LIA testy
Provedení (STA© Liatest© D-Dimer)
50 jíl vzorku
100 |il pufru
inkubace 240 s
150 ml latexového měříme činidla změnu ^^■^^^^ absorbance
mezi 12 s - 140 s
LI A testy
Kalibrace
^ Sigmoidní ^ Křivka 3. řádu
^ Minimálně 5 bodů
^ Platí pro celou šarži
ELISA metody
-^Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní
^ inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab
odsátí vzorku + promytí
^ inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag
^ odsátí AbE a promytí
detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A)
přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag
Elektroimunodifúze - El D metody
vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku
■Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu
kvantitativní metoda
Princip EID
kalibrace      vzorky pacientů
Vyšetření plazmatických proteinů
Vyšetření funkční aktivity ^ koagulační metody ^ fotometrické metody
Vyšetření antigénu
imunochemické metody
^ umožňují odlišení defektů
kvalitativních kvantitativních
Správnost laboratorních výsledků
Faktory ^ objektivní ^ subjektivní
Faktory ^ preanalytické ^ analytické ^ postanalytické
Preanalytické faktory
Příprava pacienta Odběr vzorku Transport vzorku Zpracování vzorku Skladování vzorku
Příprava pacienta
Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru Uvedení léčby
Uvedení komplikace při odběru
Odběr vzorku
Minimální zatažení paže
->Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek
První 2-3 ml nelze použít
■^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10
Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox)
Nedostatečné promíchání krve s citrátem
Nebezpečí aktivace a srážení vzorku Koncentrování citrátu u hladiny ^ automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu ^ špatné výsledky
^ ověření po stažení plazmy a promíchání
Antikoagulancia
Citrát sodný a 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno 1,129 mol/l (3,8%)
■*CTAD zkumavky
brání aktivaci trombocytů ^ doporučeno pro testy PAI-1, heparin, PF4...
Správný odběr vzorku
Vyřadit vzorky Sražené
->S chybným objemem krve (rozdíl 10%)
Hemolytické, ikterické a chylózní
hemolytický a ikterický vzorek
• ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení
chylózní vzorek
ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky
Správný odběr vzorku
Množství krve
*Méně
prodloužení koagulačních časů
APTT citlivé od 90 % objemu PT citlivé od 80 % objemu
*Více
^ zkrácení koagulačních časů??
Správný odběr vzorku
Hematokrit 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu
100 - hematokrit
ml citrátu = ------------------x ml plné krve
595 - hematokrit
Transport vzorku
Čas (max 2 hod) * Teplota (18-25°C) Mechanické vlivy (potrubní pošta)
Zpracování vzorku
Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy
Většina testů do 1 - 4 hod po odběru
* Výjimka EGT, EF (15 - 30 min), heparin, PAI-1 LA, vyšetření fcí trombocytů
Vyšetřovaný materiál
Plazma
^ plazma bohatá na trombocyty
centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace plazma chudá na trombocyty
centrifugace 15 minut 2500 g ^ bezdestičková plazma
dvojnásobná centrifugace (ultracentrifugace)
->Plná krev Sérum
Centrifugace
Výpočet otáček pro danou centrifugu *g = 1,118x10-5xrxN2
r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad:
r = 15 cm, 2500g     3860 otáček/min
Skladování primárních vzorků
Laboratorní teplota 18 - 25 °C ^ PT 6 hodin ^ APTT 4 hodiny
APTT (léčba heparinem) 1 hodinu ^ Ostatní vyšetření: 4 hod
Vyšší teplota ne
Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne
Zamrazování vzorků
Plazma chudá na destičky/bezdestičková ^ Objem > 500 ul
Zkumavka se zátkou
Správná velikost zkumavky
Zkumavka naplněná do 3/4 * Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C)
Skladování zamrazených vzorků ^1 krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 °C
Rozmrazování vzorků
Při 37 °C min. 5 minut Dobře promíchat
Opakované zamrazení není možné
Analytické faktory
Dodržování metodických postupů
Správné pracovní návyky
Správná funkce a kalibrace přístrojů
Výběr diagnostických setů a reagencií
Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů
Správně provedená kalibrace a kontroly kvality
Postanalytické faktory
Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků