Speciální koagulační
vyšetření I
Koagulační faktory
Vyšetření funkční aktivity
 jednofázová metoda na principu APTT
 FF VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK
 jednofázová metoda na principu PT
 FF II, V, VII, X
Vyšetření antigenu
 EID, ELISA
jiné faktory
VIII
?
jiné faktory
VIII
VIII
?
jiné faktory
F VIII deficitní plazmavyšetřovaná plazma
jiné faktory VIII
?
ředění 1:10 pufrem
APTT
koagulační čas závisí na aktivitě F VIII
Vyšetření funkční aktivity
koagulačních faktorů
Postup:
1 díl ředěné vyšetřované plazmy
1 díl neředěné deficitní plazmy
 FF vnitřního systému
1 díl APTT reagencie, inkubace
1 díl CaCl2
 FF vnějšího systému
inkubace, 2 díly Ca2+-tromboplastinu
stanovení koagulačního času APTT/PT
odečtení % z kalibrační křivky
Koagulační faktory - kalibrace
Kalibrační materiál
 komerční
Vyšetření
 různých ředění výchozí kalibrační plazmy s
udanou hladinou FF:100%, 50 %, 25 %,12,5% ,
(pro F VIII, IX 6,25 %, ...)
Kalibrace čtyř…více bodová
Závislost log/log (lin/log)
Klinický význam - zejména  FF ,  F VIII
Defekty faktorů
Vrozený
 hemofílie A, hemofílie B, defekt FF XII, XI,
PK, HMWK, vWF, defekt FF II, V, VII, X
Získaný
 snížená syntéza
 zvýšená spotřeba
 zvýšené ztráty
Snížení faktorů
Snížení - mimo kalibrovanou oblast (< 10 %)
Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10
 opakování vyšetření s nižším ředěním plazmy 1 : 5
 odečtení a vydělení výsledku dilučním faktorem (:2)
Kalibrační křivka Low
 kalibrovaná oblast cca 1,0 – 25,0 %
 výchozí ředění vyšetřované plazmy 1:5
Zvýšení F VIII
Zvýšení > 100 %
Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10
 opakovat vyšetření s vyšším ředěním plazmy 1 : 20
 odečíst a vynásobit výsledek dilučním faktorem (x2)
Pro F VIII > 200 %
 opakovat s ředěním 1:40
 odečíst a vynásobit 4x
Pro F VIII > 400 %
 opakovat s ředěním 1:80
 odečíst a vynásobit 8x
FVIII -fotometrická metoda
Tvorba enzymatického komplexu- tenázy
 F VIIIa aktivovaný trombinem v přítomnosti
konstantního množství F IXa, PL a Ca 2+
která aktivuje F X dodávaný v konstantním
nadbytku na F Xa
Měření tvorby F Xa pomocí chromogenního
substrátu
Korekční testy
 sledování korekce (zkrácení) APTT/PT po
přídavku normální plazmy (směs 1:1)
 prodloužení se koriguje - defekt faktorů
 prodloužení se nekoriguje nebo jen
částečně - přítomnost inhibitoru
 specifického
 nespecifického
Korekční test
 korekce
Vzorek APTT (s)
NP 35,0
1NP + 1 PP 38,0
PP 75,0
Korekční test
 není korekce
Vzorek APTT (s)
NP 35,0
1NP + 1 PP 60,0
PP 65,0
Korekční test
 jen částečná korekce
Vzorek APTT (s)
NP 35,0
1NP + 1 PP 50,0
PP 65,0
Identifikace specifického inhibitoru
screening (prodloužení APTT/PT)
průkaz inhibitoru (cirkulující antikoagulans)
průkaz specifity inhibitoru (vyšetření faktorů)
kvantifikace inhibitoru (Bethesda metoda)
Identifikace specifického inhibitoru
Inhibitor namířený proti FF, časově závislý
Orientačně tzv. „cirkulující antikoagulans“
 Vyšetření APTT/PT u vzorků plazmy pacienta,
normálu a směsí PP+NP (1+4, 1+1, 4+1)
před a po 2 hodinové inkubaci při 37 °C
Cirkulující antikoagulans
vyhodnocení výsledků
Porovnání naměřených koagulačních časů
jednotlivých směsí PP + NP s časy PP a NP
 před inkubací
 po inkubaci
Průkaz inhibitoru
 příměs 1/5 PP výrazně prodlužuje čas NP (směs 1+4)
– silný inhibitor
 není žádná/částečná korekce (směs 1+1)
 příměs 1/5 NP nezpůsobí korekci časů PP pacienta
(směs 4+1) - slabý inhibitor
Cirkulující antikoagulans
grafické znázornění
 0% = NP
 20% = směs PP+NP 1+4
 50% = směs PP+NP 1+1
 80% = směs PP+NP 4+1
 100% = PP
Cirkulující antikoagulans APTT
- defekt faktorů
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před
ink
po ink
Cirkulující antikoagulans APTT
- časově závislý inhibitor
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před ink
po ink
Cirkulující antikoagulans APTT
- časově nezávislý inhibitor
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před ink
po ink
Identifikace specifického inhibitoru
Test „cirkulující antikoagulans“
orientační vyšetření, kterým pouze prokazujeme
 přítomnost/ nepřítomnost inhibitoru
 časovou závislost/ nezávislost inhibitoru
Identifikace specifického inhibitoru
Kvantitativně Bethesda metoda
stanovení zbytkové aktivity faktoru po dvou
hodinové inkubaci různých ředění pacientovy
plazmy PP s normální plazmou NP (zdroj
faktoru)
1 Bethesda jednotka (B.U.)
množství inhibitoru, které během inkubace
inaktivuje 50 % nabídnutého faktoru
přítomnost inhibitoru  0,6 B.U.
Identifikace LA dle SSCC ISTH
 průkaz prodloužení fosfolipid závislého testu
(dAPTT, dRVVT) = screening
 průkaz inhibitoru (negativní korekční testy)
 průkaz fosfolipidové závislosti inhibitoru
(neutralizační testy)
Použití bezdestičkové plazmy (PFP)
 dvojnásobná centrifugace (ultracentrifugace)
Laboratorní diagnostikay - LA
Screening (reagencie s PL)
 dAPTT
 dRVVT (aktivuje F X v přítomnosti PL a Ca2+ )
Korekční testy
 na principu testů, kde ve screeningu R > 1,2
 vyšetření PP, NP, směsi 1:1 PP+NP bez inkubace
(časově nezávislý inhibitor)
Konfirmační testy ( PL)
 na principu testů, kde R > 1,2 a negativní korekce
 vyhodnocení zkrácení koagulačních časů
Vyšetření faktoru XIII
Stanovení funkční aktivity
 sledování rozpustnosti koagula
 fotometricky
Stanovení antigenu
 LIA
 EID
 ELISA
Testy primární hemostázy
počet trombocytů (+ morfologie)
doba krvácení (Duke, Ivy)
PFA
agregace trombocytů
retrakce koagula
Agregace trombocytů
Turbidimetrická metoda
 sledování změn průchodnosti světla (T) při
tvorbě agregátů krevních destiček
Impedanční metoda
 sledování změn vodivosti vyvolaných tvorbou
agregátů krevních destiček
Turbidimetrická metoda
Impedanční metoda
Agregace trombocytů
Agregace samovolná (spontánní)
Agregace stimulovaná (indukovaná)
 induktory ADP, kolagen, adrenalin, ristocetin
primární agregace - vlivem vnějšího podnětu
sekundární agregace - vlastní příspěvek trombo
reversibilní agregace
ireversibilní agregace
Agregace trombocytů
Postup
příprava PRP, PPP diferenciální centrifugací
stanovení počtu trombocytů (event. ředění PRP)
 PRP 250 - 300 x109, PPP <20x109
vyšetření agregace
 vložení kyvety s PPP a PRP (rozdíl T = 100%)
 sledování agregační odpovědi v PRP
 samovolná 10 min
 po přídavku induktoru 6 min
vyhodnocení agregační křivky
Vyhodnocení agregační křivky
Maximální amplituda A max (%)
 v maximu (reversibilní křivka)
 v 6. minutě (ireversibilní křivka)
Desagregace (%)
 jen u ADP v případě reversibilní křivky
Doba latence (s)
 časová prodleva před agregační odpovědí
 jen u kolagenu
 Strmost křivky = slope (%/min)
Agregační křivka
Agregace ADP 2,5
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min desagregace
0
Agregační křivka
Agregace ADP 5
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min
0
Agregační křivka
Agregace ADP 10
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min
0
Agregační křivka
Agregace kolagen
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
 T/min
latence
0
Agregační křivka
Samovolná agregace
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 10
Transmise %
pozitivní
negativní
0
Vyhodnocení - impedanční metoda
Retrakce
Schopnost trombocytů smršťovat krevní nebo
plazmatické koagulum (metoda dle Bethause)
Postup
 získání PRP sedimentací
 ředění PRP + přídavek Ca2+, Ca2+-tromboplastin
 vytvoření plazmatického koagula v graduované
zkumavce a oddělení koagula od stěn zkum.
 odečtení délky koagula po 3 hod
 odečtení % retrakce z tabulky