Detekce biomarkerů z omics experimentů •Mgr. Eva Budinská, PhD •RECETOX •budinska@recetox.muni.cz •Podzim 2019 Objeování neznámých skupin Jak se hledá potenciální biomarker v omics datech Kontrola kvality Normalizace Sumarizace Biologická otázka (hypotéza) N matic základních dat (jedna pro každý z N vzorků) Provedení experimentu (hybridizace mikročipů, hmotnostní spektrometrie...) Dizajn experimentu Objevování skupin? (Shlukování) Porovnání skupin? (Testování) Predikce skupin? (Klasifikace) Analýza přežití Analýza časových řad Charakterizace nových skupin List genů se stejným profilem změn exprese v čase Interpretace Validace Publikace Matice informací o vzorcích N x P (např. klinická data v medicíně) Finální datová matice N vzorků a K genů (proteinů) Nové skupiny genů nebo vzorků List genů s odlišnou expresí mezi skupinami vzorků Klasifikační pravidlo využívající genovou expresi Seznam prognostických genů Pathway analýza Objevování skupin Target Audience •Snažíme se vyvodit závěry o vzorcích nebo molekulách bez (braní do úvahy) jakékoliv předchozí znalostí biologických skupin (=shlukování) •Cílem je vytvořit skupiny objektů na základě jejich vzájemné podobnosti •Objekty uvnitř skupiny mají být co nejpodobnější a objekty z různých skupin mají být vzájemně tak odlišné, jak jen je to možné • Existují skupiny vzorků s podobným molekulárním profilem? Existují skupiny molekul s podobnými vlastnostmi? •Odpovídáme na otázky: Kdy provádíme shlukování v molekulární biologii •Shlukování proměných •Chceme identifikovat skupiny ko-regulovaných genů/proteinů/metabolitů… •Chceme zredukovat dimenzi dat na základě funkčních genových/proteinových/… skupin • •Shlukování vzorků •Kontrolujeme kvalitu vzorků •Chceme najít nové skupiny vzorků (například podtypy) •Chceme zkontrolovat diskriminační schopnost proměnných (genů etc….) vybraných při porovnávání známých skupin Příklady objevování skupin Omezení •Neznámá pravda – nutné co nejobjektivněji popsat skutečnost •(Ne) reprezentatívnost populace v datech •Technické možnosti •Odchylky v datech můžou podstatně ovlivnit výsledek •Typ dat určuje uhol pohledu (génová exprese vs proteinová abundance, metabolický profil, epidemiologie, histologie, DNA mutace... ) • • • Princip shlukování •Máme datovu matici X velikosti N x P •N – počet objektů (vzorků) •P – počet proměnných (geny/proteiny…) • • • • • • • • •Hledáme nejlepší rozdělení dat na skupiny tak, aby nalezené skupiny byly uvnitř skupiny vysoce homogenní a mezi sebou vysoce heterogenní N vzorků Typy shlukovacích metod •Shlukovací metody se dělí na dvě hlavní skupiny: • •Metody založené na vzdálenosti •neparametrické •nejčastěji používané, intuitivní •hierarchické a nehierarchické shlukování • •Metody založené na modelování •parametrické, kladou silné předpoklady na rozložení dat •založeny na statistickém modelování – přiřazují každému objektu pravděpodobnost s jakou patří do daného shluku Metody založené na vzdálenostech Metriky vzdálenosti Euklideovská vzdálenost •Euklideovská vzdálenost: •Standardizovaná Euklideovská vzdálenost: Tato metrika penalizuje – snižuje vzdálenost mezi objekty s velkou variabilitou, předpokládajíc, že jsou důležitější než objekty s malou variabilitou. Máme 2 vektory hodnot x = (x1, …, xn), y = (y1, …, yn) Manhattanova vzdálenost Máme 2 vektory hodnot x = (x1, …, xn), y = (y1, …, yn) Robustnější vůči odlehlým hodnotám. Metriky vzdálenosti založené na korelačním koeficientu Obzvláště často využívané u dat z omics experimentů Můžeme odvodit dvě různé metriky: d1=0.05, d2=0.19 d1=0.5, d2=1 d1=0.95, d2=0.19 Pří použití d1 budou geny s opačnými profily patřit do odlišných shluků, zatímco při použití metriky d2 budou patřit do toho stejného shluku. Pokud chceme shluky interpretovat jako množiny genů ze stejné regulační sítě, použijeme raději d2. Výběr metriky •Výběr metriky záleží na tom, jaký typ podobnosti nás zajímá • •Pokud nás zajímá podobnost hodnot (A a B jsou podobné), aplikujeme Euklidovskou vzdálenost •Pokud nás zajímá vzor hodnot (A a C jsou podobné), aplikujeme vzdálenost založenou na korelaci • • • • A B C Gene ID 0 3 2 1 4 Na co si dávat pozor I. •Mnoho shlukovacích technik najde shluky i v datech, ve kterých nejsou žádné přirozené shluky, jen proto, že byly pro tento účel vytvořeny. • •Příkladem je právě hierarchické shlukování! Na co si dávat pozor II. •Výsledek jediného shlukování by nikdy neměl být považován za objektivní reprezentaci informace skryté v datech, protože je závislý od použité metody a také v rámci metody od jejího nastavení! Další problémy Kolik shluků? •V případě nehierarchických metod počet shluků určujeme dopředu •V případě hierarchického shlukování vytváříme strom, dendrogram, který se potom prořezává •Počet shluků je následně určený tak, aby heterogenita v rámci shluků byla co nejmenší a mezi shluky co největší •Různé metriky heterogenity shluků – variabilita, Silhouette, ... Řezání dendrogamu jeho problém •U hiararchického shlukování se stanovuje fixní výška řezu dendrogramu •Problém: u omicsových molekulárních dat se často vyskytují shluky v různých výškách řezu Dynamic hybrid tree cut •Metoda dynamického prořezávání dendrogramu (Langfelder et al, 2007) •Dynamické řezání dendrogramu na základě minimální velikosti shluků, maximální výšky řezu a dalších parametrů • •Pokud vzorek nesplňuje kritéria, není zařazen do shluku! • Dynamic hybrid tree cut - základy Parametry dynamic hybrid cut •Algoritmus dynamic hybrid tree cut Robustní shlukování Konsenzuální shlukování •Forma robustního shlukování (Monti et al., 2003) • •Opakované vzorkování a shlukování jako způsob nalezení konsenzusu mezi jednotlivými výsledkami shlukování za účelem: •Určení počtu a stability shluků v datech •Vytvoření nové metriky vzdálenosti – konsenzusu • •Základní princip: •Rozrušení struktůry originální N x P datové matice pomocí náhodného výběru podmnožiny vzorků a/nebo genů •Na novém datovém souboru aplikujeme shlukovací algoritmus se stejnou mírou similarity a počtem shluků •Oba body jsou opakované L krát pro jiný počet shluků. Základní princip konsenzuálního shlukování (i) Rozrušení struktury originální N x P datové matice pomocí náhodného výběru podmnožiny vzorků a/nebo proměnných (ii) Na novém datovém souboru aplikace shlukovacího algoritmu se stejnou mírou similarity a počtem shluků • (i) a (ii) opakuj L-krát pro různé počty shluků (1, …, k) •Algoritmus • N x p Nl x p Výběr ze souboru bez opakování Matice propojení Clij=1 Když i,j spolu ve shluku, 0 jinak Shlukování Indikátorová matice Ilij=1 Když i,j spolu ve výběru, 0 jinak l = 1.. L opakování Matice konsenzusu Výběr počtu shluků k = 1 .. K shluků Konsenzuální shlukování Myšlenka konsenzuálního shlukování •Pokud se dva vzorky v jednotlivých výběrech nacházejí často spolu ve shluku, jsou důvěryhodnějšími členy shluku než ty, které se ve shluku nacházejí méně často Data bez struktury (náhodný výběr z normálního rozložení) Data se třemi skupinami A. B. Odhad počtu shluků I Kumulativní distribuční funkce Konsenzus mezi dvěma vzorky consensus003 Histogram míry konsenzusu Odhad počtu shluků II histogram_k3 histogram_k6 consensus011 6 shluků má podstatně míň vzorků s konsenzusem 1 a tím pádem jsou tyto shluky míň důvěryhodné Struktura se 3 shluky naopak vypadá jako optimum Jako rozhodovací pravidlo – rozdíl v plochách pod CDF křivkami Odhad počtu zhlukov III consensus011 consensus012 Delta = relativní změna plochy pod CDF křivkou mezi dvěma k Další metriky konsenzuálního shlukování Konsenzus shluku k Konsenzus vzorku si v k-tém shluku Obě míry se používají pro identifikaci odlehlých hodnot (vzorky s nízkou mírou konsenzu k jakémukoliv jinému vzorku v jinak homogenním shluku; shluky s nízkou mírou konsenzu obecně) kde je indikátorová funkce Metody založené na modelech Skeleton •Modely Gaussových směsí (mixture models) •Předpokládají, že naměřené hodnoty genu/proteinu g ve všech vzorkách (Xg) jsou náhodným výběrem a jejich rozložení závisí na skupině do které gen g patří •Náhodnost Xg souvisí s pozorovanou variabilitou v datech z genomických a proteomických experimentů •Na rozdíl od metod založených na vzdálenosti poskytují tyto modely: •odhad parametrů, které charakterizují každou skupinu (průměr, rozptyl, …) •pravděpodobnost příslušnosti genu ke každé ze skupin •statistické kritéria pro výběr počtu skupin Modely Gaussových směsí Pokud objekt patří do více skupin shluků •Většina shlukovacích technik vytváří disjunktní shluky: každý objekt je součástí jediného shluku • •Toto zvlášť v genomice a proteomice nemusí být nejlepší přístup, protože většina proteinů/genů je součástí více biologických drah -> proto by měli patřit do více skupin • •Jak zohlednit tuto informaci: •Aplikujeme speciální shlukovací metody (například fuzzy clustering) •Aplikujeme metody založené na modelech a vyvodíme závěry z přiřazených pravděpodobností • •Biclustering (two-way clustering) shlukuje zaráz řádky i sloupce Jak shlukovat efektivně •V genomice a proteomice obvykle nemá význam shlukovat úplně všechny objekty (proteiny/geny) •Většina z nich není významná •Vnášejí do procesu šum, který zakryje pravou strukturu dat •Je vhodné zredukovat dimenzi dat: •PCA, gene-shaving, … - dokáží extrahovat informaci o genech/proteinech s podobnými charakteristikami, stačí potom ve shlukování reprezentovat charakteristikami těchto skupin •Redukce na základě SD anebo CV •Problémy shlukování u omicsových molekulárních dat • -Šum v datech negativně ovlivňuje výsledky -Jedna veľká množina genů (proteinů, metabolitů) ze stejného biologického motivu ovplyvní zásadně shluky Kde hledat shluky •Data můžou vytvářet shluky v odlišných dimenzích Kde hledat shluky II. •V případě, že předpokládáme shlukování v nižších dimenzích, můžeme: •Hledat v nižších dimenzích vytvořených PCA •Použijeme podprostorové shlukovací algoritmy, které jsou schopné detekovat shluky, které existují ve více podprostorech a mohou se překrývat Podprostorové shlukovaní •Hledá shluky ve všech podprostorech •Počet podprostorů je 2d, kde d je počet dimenzí (počet genů/proteinů) • •Typy algoritmů: •Top-down – najde iniciální rozložení na všech dimenzích a potom se dívá na podprostory každého shluku, iterativně zlepšují výsledky •Bottom-up – najdou regiony v nižších dimenzích a potom je zkombinují a vytvoří shluky •MAFIA (Nagesh, 1999) •ENCLUS (Chen, 1999) •COSA (Damian et al., 2007) •SMART (Jing et al., 2009) > library(orclus) Vizualizace výsledků •Správná vizualizace výsledků je nejdůležitější součást analýzy! Boxploty exprese genů Vizualizace korelací mezi vzorky Alizadeh et al., Nature 403:503-11, 2000 Validace ve shlukování molekulárních dat Jak validovat, když neznáme pravdu??? Jak validovat, když neznáme pravdu??? Shrnutí Kolorektálny karcinóm •příklad http://www.svod.cz/graph/?sessid=61i5m59sfegpf475nq008cr8e2&typ=incmor&diag=C18&pohl=&kraj=&vek_od= 1&vek_do=18&zobrazeni=graph&incidence=1&mortalita=1&mi=0&vypocet=w&obdobi_od=1977&obdobi_do=2009&st adium=&t=&n=&m=&pt=&pn=&pm=&t=&n=&zije=&umrti=&lecba=## http://2.bp.blogspot.com/-IZzLWFUVOsE/TV_v_Vb55cI/AAAAAAAAA3o/KZ2ONi0jG5E/s320/colon-cancer.png.jpg •Heterogénne ochorenie s rozdielnou odpoveďou na terapiu. •Len niekoľko klinicky používaných markerov: -BRAF/KRAS mutácia – pre kvalifikáciu na antiEGFR terapiu (u štádia s metastázami) -MSI – mikrosatelitová nestabilita – všeobecne považovaná za dobrý marker • • •Cieľ: •Nájsť skupiny nádorov kolorekta s podobnou expresiou génov (podobným génovým profilom) ~ podtypy • •Charakterizovať tieto podtypy pomocou klinických a známych molekulárnych parametrov. •Dátové súbory: •Matica obsahujúca kvantitatívnu expresiu génovej aktivity nádorov • • N x p, k=1..5 • • •Matica klinických a molekulárnych parametrov ku každej nádorovej vzorke, vrátane prežitia pacienta Vzorky nádorov Gény VÝBER PREMENNÝCH / Zmenšenie dimenzie dát • •Nezávislý výber – z 25 000 génov, výber podmnožiny 3025 génov s najvyššou variabilitou v súbore 1. 1. • •Redukcia dimenzionality – práca s génovými modulmi •génový modul – sada génov s rovnakou génovou expresiou • •Jedná sa o istú formu váženia efektu biologických motívov • •Predpoklad: •sada korelovaných génov ~ biologický motív • Príklad EMT •EMT – epiteliálno mesenchymálny prechod •Génová expresia podobná zdravému mezenchymálnemu tkanivu •Obvykle reprezentovaný zmenou v stovkách génov •Identifikácia modulu EMT a jeho reprezentácia jedinou hodnotou (priemerom) zmenší jeho efekt v zhlukovaní a dá šancu ďalším dôležitým procesom reprezentovaným menším množstvom génov http://cnx.org/content/m36053/latest/emt.png 3025 génov Dátový súbor 1 150 génových modulov Pearsonova korelácia, Hierarchické zhlukovanie Complete linkage Rezanie dendrogramu Výber 54 modulov (625 génov) Validácia ich korelácií v 4 ďalších dátových súboroch 54 Meta-génov Medián génov v module Pearsonova korelácia, Hierarchické zhlukovanie Complete linkage Rezanie dendrogramu 8 hlavných zhlukov ~ hlavné biologické motívy Identifikácia biologických motívov •Analýza génových •sád • • • • • •Biol motív: •EMT, proliferácia, •Chromozóm 20q... V genóme V biol motíve V genóme a b V module c d • •Cieľ: •Nájsť skupiny nádorov kolorekta s podobnou expresiou génov (podobným génovým profilom) ~ podtypy • •Charakterizovať tieto podtypy pomocou klinických a známych molekulárnych parametrov. Motívy génovej expresie v podtypoch Hierarchické zhlukovanie na matici konsenzusu Analýza génových sád Expresné profily pre jednotlivé podtypy •Klasifikátor LDA (linear discriminant analysis) Minimálna génová sada •Selekcia génov pomocou elastic net – počíta s korelovanými génmi (neodstraňuje len jeden gén, ale všetky korelované) •Klasifikátor vytvorený na selektovaných génoch (shrunken centroids) Subtype Minimálna génová sada A CLCA1, PADI2, ADTRP, RETNLB, TIMP3, MUC2, FNDC1, NR3C2, SULF1, B3GNT7, STYK1, CHI3L1 B FARP1, ALOX5, FSCN1, HNF4A, RARRES3, MYRIP, GPSM2, TSPAN6, CCDC113, CDHR1, KCTD12, SGK1, BASP1, MT1E, GPX8, RPS6KA3, SOCS3, SLC5A6, PRR15, PLAGL2, IHH, CREB3L1, TP53RK, YAE1D1, EPB41L3, QPRT, KCNK5, RNF43, VAV3, CXCR4, ITPRIP, GRM8, GFPT2, KCNMA1, KIAA0226L,RNASE1 C TFAP2A, ATP9A, RAB27B, ANP32E, CXCL14, IDO1,RARRES3, EGLN3, KIAA0226L,C10orf99,RPL22L1, PLK2 D PRICKLE1, RBM47, TAGLN, BOC, HOOK1, C7, ANK2, DCHS1, DDR2, CRYAB, GEM E REG4, IL6, CXCL5, RAB27B, CEACAM6, PI15, MRPS31, RAP2A, UQCC, AGR3, HSD11B1, IL1B • •Cieľ: •Nájsť skupiny nádorov kolorekta s podobnou expresiou génov (podobným génovým profilom) ~ podtypy • •Charakterizovať tieto podtypy pomocou klinických a známych molekulárnych parametrov. Vzor expresie biologických motívov •Analýza génových sád pomocou KS testu Rozdiely v prežití •Kaplan-Meierove krivky prežitia •Coxov model proporcionálnych rizík (efekt štádia vs podtypov) •Rozdiel od populačnej baseline u každého podtypu pomocou Fisherovho exaktného testu, FDR úprava p-hodnôt Charakterizácia podtypov klinickými a molekulárnymi premennými Histologické rozdiely •Fisherov test, adjustácia na FDR https://encrypted-tbn0.google.com/images?q=tbn:ANd9GcQx9PDcYUFLmoVlWSFJUtjiLVnpUW2ZmgIhnIVLmvvo9uYS UKP- •Podtyp A – Surface crypt like - KRAS mutanti, papillary a serrated morfotyp, najviac diferencovaný, bez aktívnej Wnt signálnej dráhy. Dobrý OS a RFS. • Podtyp B – Lower crypt like – diferencované ale bez sekrečných buniek, proliferujúce, a aktívnou Wnt signálnou dráhou. Komplexný tubulárny morfotyp. Časo MSS, BRAFwt, nižšieho grádu, dobré prežitie v OS, RFS i SAR. • Podtyp C – CIMP-H like - časo MSI, BRAF-mutantné, hypermutované, z pravej časti hrubého čreva. Histologicky - horšie diferencované, solídno-trabekulárne s mucínovéým morfotypom. Aktívne proliferujú a majú silnú imunitnú reakciu. Dobrý RFS, ale zlý OS and SAR. • Podtyp D – Mesenchymal – markery kmeňových buniek, veľa mezenchymálnych buniek, ktoré sa prejavujú expresiou EMT génov. Wnt signálna dráha je neaktívna a proliferácia nízka. Klinické a mutačné charakteristiky sa nelíšia od populačnej baseline. Majú najkratšie prežitie do relapsu, zlý OS a SAR. Podtyp E – Mixed – často MSS, BRAFwt, z ľavej strany hrubého čreva. Podobne ako podtyp D exprimuje gény kmeňových buniek a EMT procesu, avšak podobne s B má vysokú aktiviu kanonickej Wnt dráhy a vyzerá viac diferenciovaný. Je podobný B – komplexný tubulárny, len častejšie obsahuje mutáciu p53. • Validace podtypů kolorektálního karcinomu •Validácia algoritmu a parametrov modelu na testovacom súbore • •Keď zopakujem celú procedúru na inom súbore, dostanem podobné skupiny? • Cluster/subtype in validation set Subtypes from training set most correlated to validation subtypes First subtype Second subtype Subtype Cor P-val Subtype Cor P-val C1 / A A 0.85 p<1.0E-15 F 0.41 p<1.0E-15 C2 / B1 B 0.71 p<1.0E-15 E 0.47 p<1.0E-15 C3 / B2 B 0.91 p<1.0E-15 A 0.36 p<1.0E-15 C4 / C C 0.89 p<1.0E-15 F 0.29 p<1.0E-15 C5 / D D 0.93 p<1.0E-15 E 0.37 p<1.0E-15 C6 / E E 0.63 p<1.0E-15 D 0.58 p<1.0E-15 C7 / F F 0.61 p<1.0E-15 C 0.55 p<1.0E-15 Cluster/subtype in validation set LDA assignment SUM A B C D E C1 / A 74 4 3 3 0 84 C2 / B1 1 58 0 2 13 74 C3 / B2 12 134 1 0 1 148 C4 / C 1 2 99 4 0 106 C5 / D 0 3 12 64 7 86 C6 / E 1 17 0 17 13 48 C7 / F 23 1 22 9 1 56 Non-core 21 53 18 8 18 118 SUM 133 272 155 107 53 720 •Validácia konceptu pomocou klinických, molekulárnych a histologických charakteristík objavených skupín • •Majú objavené skupiny biologickú podstatu / odrážajú známe vedecké poznatky? • •Je rozloženie týchto charakteristík medzi podtypmi porovnateľné vo validačnom súbore? • • •Majú objavené skupiny biologickú podstatu / odrážajú známe vedecké poznatky? •Podtyp C – pravostranné, BRAFm, MSI nádory, ktoré sú známe zlým prežitím po relapse • • • • • •Zvýšená expresia génov chr. 20q v podtype B by mohla znamenať amplifikáciu chr20q regiónu. • • • •Podtyp D – mezenchymálny – histologické vyhodnotenie: v nádore prítomná silná desmoplastická reakcia (mezenchymálne tkanivo) • • • • • Nádor •Je rozloženie klinických charakteristík medzi podtypmi porovnateľné vo validačnom súbore? Dataset 1 Dataset 2 Dataset N 1 3 4 Definícia podtypov karcinómu Klinické dáta 2 Prežitie Iné zdroje dát (CNV, metylácia...) Molekulárny profil Rezistencia na liečbu Right MSI KRAS BRAF 35% 25% 10% 10% 15% ... 0% ... 50% ...