1 Indikace dopadů stresu na vitalitu in-vitro kultivovaných rostlin pomocí pokročilých metod fluorescence chlorofylu Miloš Barták Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie a anatomie rostlin, Laboratoř fotosyntetických procesů, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Univerzitní kampus Bohunice, Kamenice 5, 625 00 Brno ABSTRACT Chlorophyll fluorescence technique represents an important tool for estimation of plant photosynthetic performance and evaluation of effects of particular stress factors on plant vitality. It is widely-exploited method in photosynthetic studies of higher plants and other photosynthetizing organisms such as e.g. cyanobacteria, algae, lichens and mosses. Recently, there are numerous application of chlorophyll fluorescence ranging from purely photosynthetic to ecophysiological and plant stress studies. Among them, short- and longterm photosynthetic measurements in the field, pre- and post-harvest control of fruits, growth and vitality control in algal biotechnologies are of great importance. In plant tissue cultures and in vitro cultivated plants, the method has met less frequent exploitation than in naturallygrown plants. Since the 90-ies of the last century, however, an increasing number of fluorometric studies in in vitro plants has been published. Recently, variety of methods based on chlorophyll fluorescence technique is used in in vitro studies. This paper brings a theoretical background, overview of recently used fluorometric methods, and commented examples of their typical applications. The emphasis is given to the most recent and advanced techniques, the use of which is expected to expand in the nearest future. ÚVOD Metody měření fotosyntézy se obecně dělí na destruktivní (založené na vážení přírůstku biomasy rostlin vzniklé fotosyntetickou činností) a nedestruktivní (metody založené na biochemickém či biofyzikálním principu). V posledních desetiletích nabývají na významu především metody nedestruktivní (přehledně viz např. Millan-Almaraz et al. 2009), které můžeme dále rozdělit na (1) manometrické (změny tlaku měřené pomocí Warburgova přístroje), (2) elektrochemické (přímé měření fotosyntetického vývinu kyslíku pomocí Clarkovy kyslíkové elektrody, (3) měření výměny plynů pomocí infračervených analyzátorů plynů (fotosyntetická fixace CO2 v uzavřené měřící komoře), (4) izotopová měření (využívající značeného uhlíku 14 C), (5) metody fotoakustické, (6) matematické modelování (např. biochemické modely fotosyntézy (přehledně např. Farquhar et al. 2001) založené na oxygenační/karboxylační schopnosti enzymu RUBISCO odvozené ze základní studie Farquhar et al. (1980) a v neposlední řadě (7) metody založené na principu měření indukované fluorescence chlorofylu. V tomto příspěvku je hlavní pozornost věnována detailnímu popisu fluorometrických metod a jejich aplikaci v experimentech zaměřených na in vitro kultivaci rostlin. Jednotlivé metody jsou charakterizovány, jsou uvedeny jejich výhody a nevýhody a typické využití. Vyžádaný příspěvek 2 Principy metody fluorescence chlorofylu a postupy měření Pro studium fyziologických, zejména produkčních a růstových procesů rostlin kultivovaných in vitro má zásadní význam nedestruktivní stanovení jejich okamžitého fyziologického stavu, a to bez narušení vnitřního prostředí kultivační nádoby. Z tohoto pohledu je měření fluorescence chlorofylu, respektive odvozených fotosyntetických parametrů velmi vhodnou a perspektivní metodou. V poslední době bylo uveřejněno několik přehledných prací, které se zabývají metodami měření fluorescence chlorofylu, charakteristikou a rozborem jednotlivých parametrů fluorescence chlorofylu a jejich typickými aplikacemi ve fyziologii rostlin, např. Roháček et Barták (1999), Maxwell et Johnson (2000). V případě studií uskutečňovaných na rostlinách pěstovaných in vitro je však využití těchto metod omezeno technickými parametry kultivačních nádob. Přesto se v současné době fluorometrické metody využívají stále ve větší míře. Jsou-li in vitro studie zaměřeny specificky na stanovení rychlosti fotosyntézy, respektive jejího ovlivnění konkrétními růstovými podmínkami, pak velkou výhodu představují experimenty, ve kterých je fotosyntéza měřena souběžně jak gazometrickými metodami (výměna plynů mezi rostlinou a okolím, stanovení rychlosti fotosyntetické fixace CO2), tak metodami fluorometrickými (např. Fila et al. 2006). Takové experimenty umožňují kauzální analýzu limitních faktorů fotosyntézy, neboť mohou korelovat fotosyntetické parametry vztahující se k fotochemické i biochemické části fotosyntézy. V těchto studiích lze zjištěné změny rychlosti fotosyntézy rostlinného materiálu in vitro přiřadit konkrétnímu faktoru, například teplotě listu, relativní vlhkosti vzduchu nebo vodivosti průduchů. Metoda saturačních pulsů Principem metody je sledování odezvy velikosti emise fluorescence chlorofylu poté, co rostlinu vystavíme krátkodobě pulsu silného světelného záření. Tato metoda se používá pro stanovení maximální a aktuální rychlosti přenosu energie ve fotosystému II a návaznými redoxními systémy membrány thylakoidu. Metoda je založena na principu potlačení fotochemické cesty fotosyntézy, kterého je možno dosáhnou krátkým, ale silným zábleskem (pulzem fotosynteticky aktivního záření) z vhodného umělého zdroje. Krátké saturační ozáření způsobí úplnou redukci chinonu QA a tím i dočasné zastavení transportu elektronů ve fotosystému II. Pomocí této metody stanovujeme dva základní parametry fluorescence chlorofylu, a to (1) FV/FM (rostlinný materiál je před vystavením saturačního pulsu v temnotně adaptovaném stavu) a (2) kvantový výtěžek fotochemických procesů ve fotosystému II (PSII). Poměr FV/FM je často v odborné literatuře nazýván několika synonymy, např. základní fluorescenční poměr, maximální kvantový výtěžek, potenciální kvantový výtěžek, kapacita fotochemických procesů ve fotosystému II. S ohledem na skutečnost, že FV/FM patří k nejsnáze měřeným fluorescenčním parametrům a že pokles jeho hodnoty velmi citlivě indikuje působení stresu ve fotosyntetickém aparátu, je jeho uplatnění v rostlinných in vitro studiích velmi rozsáhlé a příkladů využití je velmi mnoho. Proto na tomto místě uvádím pouze jeden příklad, další jsou uvedeny v následujícím textu při popisu typických aplikací v in vitro kulturách. Pomocí hodnot FV/FM lze například stanovit rozdíly ve fotosyntetickém aparátu způsobené stářím listů in vitro kultivovaných rostlin (Huang et al. 2003). Pomocí metody saturačních pulsů můžeme stanovit i takzvané fotochemické a nefotochemické zhášení fluorescence chlorofylu (blíže viz následující text), které nám napovídají, jaký podíl absorbované energie je fotosyntetickým aparátem využit pro fotosyntézu (tedy syntézu ATP, NADPH a následnou fixaci CO2) a jaký díl je využit na doprovodné procesy (např. přeměnu absorbované energie na teplo). Proporce mezi 3 fotochemickým a nefotochemickým zhášením fluorescence chlorofylu velmi citlivě odráží působení stresu na rostliny, a je proto velmi vhodným indikátorem stresu. Kautského pomalá indukční kinetika Kautského pomalá indukční kinetika fluorescence chlorofylu je definována jako časová odezva fluorescence chlorofylu získaná na předzatemněném rostlinném vzorku během ozáření trvajícím řádově jednotky minut (Obr. 1). Po ozáření, které je u moderních měřících aparatur vytvářeno přímo světelným zdrojem zabudovaným v přístroji (fluorometru), dojde k nárůstu hodnot fluorescence na úroveň FP (angl. peak) a poté postupně klesá na úroveň takzvané rovnovážné fluorescence FS (angl. steady-state fluorescence). Tento tradiční měřící postup je často doprovázen přidáním saturačního pulsu v temnotně či na světlo adaptovaném vzorku. Po saturačním pulsu je zaznamenán nárůst fluorescence do maximální úrovně FM (temnotně adaptovaný vzorek) či F´M (vzorek adaptován na světlo). Jednotlivé hodnoty fluorescence chlorofylu získané tímto měřícím postupem se využívají pro výpočet fotosyntetických parametrů fluorescence chlorofylu (viz Tabulka 1). 0 15 29 44 59 73 88 102 117 132 146 161 176 190 205 220 234 Čas ( s ) Fluorescence(mV) FP FS FM F'M F0 F0 F'0 FM F'M FV(S) FV(M) Obr. 1. Příklad záznamu Kautského křivky fluorescence chlorofylu se dvěma saturačními pulzy (v čase: 15 s, 210 s). Šipkami jsou vyznačeny základní charakteristiky (hodnoty signálů fluorescence chlorofylu: F0, FM, FV, FS, F´M, F´0) nezbytné pro výpočet parametrů FV/FM, qP, qN, II. Fotochemické a nefotochemické zhášení Termín “zhášení fluorescence chlorofylu“ v sobě zahrnuje veškeré procesy probíhající v thylakoidní membráně chloroplastu, které snižují hodnotu fluorescence pod její maximální hodnotu. Jedná se o procesy (mechanismy), kterými je excitační energie odváděna z reakčních center (RC PS II). Fotochemické zhášení fluorescence chlorofylu závisí na množství přítomného QA v oxidovaném stavu. Proces reoxidace QA tedy způsobuje fotochemické 4 zhášení fluorescence, neboť přenos elektronů z QA na následující elektronové přenašeče (QB, plastochinonový zásobník, komplex cytochromů b6-f, atd.) je obvykle ukončen tvorbou NADPH, který je následně využit v biochemické části fotosyntézy. Fotochemické zhášení fluorescence chlorofylu je vyjádřeno koeficientem fotochemického zhášení fluorescence chlorofylu (qP), který je ekvivalentem množství excitační energie zachycené a přeměněné na chemickou energii v reakčním centru PS II. Nefotochemické zhášení fluorescence chlorofylu (qN) v sobě zahrnuje všechny procesy působící pokles kvantového výtěžku fluorescence, které nejsou bezprostředně spjaty s redoxním stavem QA. Nefotochemické zhášení je tvořeno třemi základními součástmi podle charakteru fyziologického procesu, který se ve fotosyntetickém aparátu uplatňuje: qE energetické zhášení fluorescence (závislé na pH gradientu) qT zhášení způsobené odpojením LHC II (fosforylací) a jejich přesunem od PS II k PS I qI fotoinhibiční zhášení fluorescence (působené radiačním stresem) Pro stanovení těchto součástí je nezbytné vystavit rostlinný materiál saturačním pulsům, a to s využitím speciálního postupu (blíže viz Roháček et al. 2008). Matematicky pak platí, že qN = qE +qT +qI. Tabulka 1. Základní parametry fluorescence chlorofylu odvozené z pomalé indukční kinetiky (Kautského kinetika) doplněné o saturační pulsy (zkompilováno z různých literárních zdrojů). Parametr Název Rovnice výpočtu FV variabilní fluorescence FV = FV(M) = FM – F0 FV/FM základní fluorescenční poměr FV / FM = (FM – F0) / FM PSII kvantový výtěžek elektronového transportu PS II PSII = (FM’- FS) / FM’ qP fotochemické zhášení fluorescence qP = (FM’ - FS) / (FM’ – F0) q(P)rel relativní fotochemické zhášení fluorescence q(P)rel = (FM’ – FS) / (FM - F0) qN nefotochemické zhášení fluorescence qN = (FM - FM’) / (FM – F0) q(N)rel relativní nefotochemické zhášení fluorescence q(N)rel = [(FM – F0) – (FM’ – F0’)] / (FM – F0) NPQ nefotochemické zhášení fluorescence NPQ = (FM - FM’) / FM’ qI odhad koeficientu fotoinhibičního zhášení fluorescence qI = 0,832 - (FV / FM) qo zhášení základní fluorescence qo = (F0 – F0’) / F0 Rfd relativní pokles fluorescence (syn. index vitality) Rfd = (FP – FS) / FS Rychlé indukční kinetiky Rychlá indukční kinetika fluorescence chlorofylu je definována jako nárůst fluorescence chlorofylu, který je zaznamenán na temnotně adaptovaném (zatemněném) vzorku fotosyntetizujícího organismu během prvních jednotek sekund poté, co byl vzorek vystaven velmi krátkému působení (1-2 s) záření. Kinetika má typický polyfazický charakter, který vykazuje několik významných bodů (úrovní), které jsou označeny symboly písmen O, J, I, P 5 (Obr. 2). Proto se tyto kinetiky někdy v odborné literatuře uvádí jako OJIP křivky (Strasser et al. 2004). Bod „O“ označuje "počáteční fluorescenci (angl. Origin)" a odpovídá úrovni základní fluorescence, která bývá v jiných studiích také označována zkratkou F0. Body značené jako „J“ a „I“ odráží krátkodobou rovnováhu mezi množstvím excitační energie absorbovaného záření v PS II a odčerpáváním (přenosem) této energie pomocí redoxního stavu chinonů. Hodnot fluorescence typické pro body „J“ a „I“ je dosaženo ve velmi krátkém časovém úseku od okamžiku ozáření vzorku: 2 a 30 ms. Úroveň fluorescence chlorofylu označená „P“ (angl. Peak) představuje maximální dosaženou hodnotu (FP). Obecně platí, že postupný nárůst fluorescence chlorofylu z úrovně O do úrovně P odráží postupné hromadění redukovaného chinonu (QA) a inhibici elektronového transportu systémem přenašečů v thylakoidní membráně chloroplastu (Lazár 2009). Tabulka 2. Základní parametry fluorescence chlorofylu odvozené z rychlé indukční kinetiky (OJIP). Vyznačení jednotlivých úrovní fluorescence chlorofylu: O, J I, P (viz Obr. 2). Další (specializované) parametry odvozené z OJIP křivky lze nalézt např. v práci (Strasser et al. 2004, Stirbet et Govindjee 2011), zde neuvedeno. FO základní (pozadí) fluorescence chlorofylu na úrovni O (počátek křivky) FJ fluorescence chlorofylu na úrovni J (obvykle na 2 ms) FI fluorescence chlorofylu na úrovni I (typicky na 300 ms) FP fluorescence chlorofylu na úrovni P (peak) FV variabilní fluorescence chlorofylu, FV = FP - FO (nebo FV = FM – FO jako maximum) t1/2 čas, kdy je dosaženo poloviny FP (nebo FM) tP čas, kdy (nebo FM) FP je dosaženo F0/ FP poměr základní a maximální úrovně fluorescence chlorofylu FV / FP poměr variabilní a maximální úrovně fluorescence chlorofylu, VJ relativní fluorescence chlorofylu na úrovni J, VJ = (FJ - FO) / (FM - FO) VI relativní fluorescence chlorofylu na úrovni I, VI = (FI - FO) / (FM - FO) Plocha plocha nad kinetikou fluorescence chlorofylu vymezena vodorovnou čárou v místě FP a vertikální čarou v místě FO Rychlé indukční kinetiky fluorescence chlorofylu se ve studiích zaměřených na detekci stresu u rostlin pěstovaných in vitro dosud využívají v omezeném rozsahu, i když první aplikace této metody se datuje již do devadesátých let minulého století. Romano et al. (1996) analyzovali pomocí křivek OJIP úspěšnost přemístění rostlinek Quercus suber z in vitro do ex vitro podmínek v závislosti na jejich předchozí in vitro inokulaci mykorhizními houbami. Zjistili, že mykorhiza zvyšuje kvantový výtěžek fotochemických procesů fotosyntézy, stejně jako elektronový transport a metabolismus fotosyntézy. V posledních letech podobně Swain et al. (2010) pomocí této metody sledovali úspěšnost aklimace rostlin Solanum nigrum po přenosu z in vitro do ex vitro. V naší laboratoři využíváme křivky OJIP pro detekci stresu ve fotosyntetickém aparátu Potinara hybr. způsobeného kultivační ozářeností v in vitro podmínkách a působením krátkodobého radiačního stresu (fotoinhibice) – viz. Obr. 2 Fluorescenční emisní spektra Spektrální fluorescenční emisní křivka je definována jako emise fluorescence z fotosyntetizujícího objektu měřeného ve spektrální oblasti 640-800 nm. Změny průběhu spektrálních křivek, zejména hodnot fluorescence, příslušející jednotlivým fotosystémům zjištěné ve specifických vlnových délkách (690 nm: PS II, 740 nm: PS I), jsou považovány za citlivý indikátor působení stresu ve fotosyntetickém aparátu rostlin (např. Pedrós et al 2008). Fluorescence je indukována silným světlem z různých zdrojů (lampy s různým emisním spektrem). V poslední době se často uplatňuje i přístup laserem indukované fluorescence chlorofylu. Pomocí této metody například Muñoz-Muñoz et al. (2007) sledovali u in vitro pěstovaných rostlin Saintpaulia ionantha změny ve fotosyntetickém aparátu vyvolané indukcí organogeneze a v jejím dalším průběhu. 6 Obr. 2. Průběh rychlých indukčních křivek OJIP na protokormech Potinara hybr. měřený ve 14-denním intervalu v průběhu in vitro kultivace. Kontrolní rostliny (modrá čára) byly krátkodobě vystaveny silnému fotoinhibičnímu stresu (1000 mol m-2 s-1 po dobu 30 min.). Fotoinhibice se projevuje jako pokles (viz šipky) hodnot fluorescence chlorofylu (červená čára) a změna odvozených parametrů, například (FP-FO/FP) - Róth, Barták, Dubová, Rotkovská (nepublikovaná data). Změny ve fotosyntetickém aparátu v průběhu in vitro kultivace jsou zřejmé při porovnání mezi levým (14.11.2011) a pravým panelem (27.11.2011). Zjištění stresu v průběhu in vitro kultivace Měření parametrů fluorescence chlorofylu v průběhu in vitro kultivace naráží na jistá omezení. Pouze u nevelkého počtu specializovaných aparatur vyrobených zpravidla na zakázku je sonda fluorometru umístěna přímo v kultivační nádobě. Proto se většina experimentů omezuje na fluorometrická měření uskutečněná přes stěnu kultivační nádoby, tj. sonda fluorometru obsahující detektor fluorescenčního záření je umístěna vně nádoby. Toto uspořádání přináší metodické problémy, neboť je třeba vzít v úvahu optické vlastnosti materiálu stěny komory (absorpci, propustnost pro vlnové délky viditelného záření a fluorescenčního signálu), možné interakce záření jak se stěnou nádoby, tak s kondenzačními kapkami vody na vnitřních stěnách nádoby (mnohonásobné odrazy). Proto se zpravidla fluorometrické parametry zjišťují v průběhu opakovaného otevření kultivační nádoby ve sterilním prostředí, především při pravidelné výměně media (viz níže: opakovaná měření s různým časovým krokem). Metody můžeme rozdělit do dvou základních skupin: (1) kontinuální měření vycházející z automatické registrace fluorescence chlorofylu pomocí řídící a záznamové jednotky fluorometru – např. Róth et al. (2010) a (2) opakovaná měření s různým časovým krokem (zpravidla jednotky dnů nebo týdnů) – např. Zanandrea et al. (2006). Příkladem prvního přístupu je využití přístroje Moni-PAM (H.Walz, Germany) pro měření změn (aklimační reakce) kvantového výtěžku fotosyntetických procesů ve fotosystému II (PSII) během dlouhodobé kultivace po převodu rostlin namnožených in vitro na agarem ztuženém médiu do bioreaktoru s tekutým médiem pracujícího na principu dočasně zaplavovaných kultur (Obr. 3). 7 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 Kultivační období (27.10.-30.10.2009) kvantovývýtěžekPSII 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 Kultivační období (27.10.-30.10.2009) kvantovývýtěžekPSII 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450 0,500 0,550 0,600 Kultivační období (27.10.-30.10.2009) kvantovývýtěžekPSII Obr. 3. Denní chody hodnot kvantového výtěžku fotochemických procesů ve fotosystému II (PSII) pro experimentální druh Dionaea muscipula (A), Nephrolepis exaltata (B) a orchidej Potinara hybr. (C) pěstovaných v kultivačních boxech s řízeným režimem den/noc. U druhů Dionaea muscipula a Nephrolepis exaltata je jasně patrná postupná aklimace na kultivační ozářenost (trvalý trend mírně klesajících hodnot, zatímco orchidej Potinara je velmi dobře přizpůsobena kultivačnímu záření od počátku kultivace v bioreaktorech RITA®. Kapradinu ledviník (Neprolepis exaltata) můžeme na základě dat charakterizovat jako senzitivní vůči fotoinhibici, neboť v křivkách jsou patrné výrazné krátkodobé aklimační reakce hodnot kvantového výtěžku PS II na přechody světlo/tma a tma/světlo (viz šipka). Vysoký stupeň senzitivity vůči fotoinhibici potvrzují rovněž velmi malé hodnoty kvantového výtěžku (pod 0,2) na konci zobrazeného období (30.10.2009). – Dubová (2010) A B C PSIIPSIIPSII Kultivační období (27.10.-30.10.2009) Kultivační období (27.10.-30.10.2009) Kultivační období (27.10.-30.10.2009) 8 Druhý přístup závisí na délce časového kroku, ve kterém jsou fluorometrická měření uskutečňována. Může jít jak o relativně často opakovaná měření v několikadenních odstupech (Genoud et al. 1999), tak o měření prováděná v několikatýdenním intervalu – např. Serret et al. (2001b) u Gardenia jasminoides. Délka časového intervalu opakovaných měření se zpravidla řídí četností pasážování. Během pasážování lze uskutečnit i detailní fluorometrická měření využívající pomalou Kautského kinetiku fluorescence chlorofylu doplněnou o analýzu zhášecích mechanismů fluorescence chlorofylu. Tento přístup umožňuje přesnou kauzální analýzu procesů probíhajících v in vitro kultivovaných rostlinách, neboť poskytuje širokou sadu fluorescenčních parametrů: F0, FV/FM, qP, qN, NPQ, Rdf - blíže viz Principy metody fluorescence chlorofylu a postupy měření (Tabulka 2). Pomocí této metody Zanandrea et al. (2006) zjistili, že fotoochranné mechanismy fotosyntézy jsou aktivovány u in vitro kultivovaných rostlin Malus domestica při aplikaci doplňkového, krátkodobého záření. Chlorophyll fluorescence imaging Rozvoj měřící a záznamové přístrojové techniky, který je zvláště zřetelný v posledních dvou desetiletích, umožňuje uplatnit metodu dvou i třírozměrného zobrazení fluorescence chlorofylu (chlorophyll fluorescence imaging) ve fotosyntetizujících organismech (Roháček et al. 2008). Podstatou této metody je zobrazení fotosyntetizujícího objektu, například listu, který buď v odstínech škály šedi nebo v nepravých barvách zobrazuje pro jednotlivý grafický pixel jak hodnotu fluorescenčních signálů (např. F0, FM, FS – blíže viz Principy), tak hodnotu jednotlivých parametrů fluorescence chlorofylu, které mají přesný fyziologický význam (například FV/FM, PSII, NPQ). Díky technickým omezením souvisejícím s dlouhodobým umístěním in vitro pěstovaných rostlin ve sterilizovaných uzavřených nádobkách a nutností umístit kinetickou CCD kameru co nejblíže měřeným objektům se tato technika využívá v experimentech zaměřených na rostliny pěstované in vitro méně často než u celých, volně pěstovaných rostlin. Poprvé byla metoda chlorophyll fluorescence imaging využita v devadesátých létech minulého století (Smith 1995). První studie využívaly zejména změn parametru FV/FM v průběhu kultivace, např. Omasa (1996) měřil postupný rozvoj fotosyntetické aktivity v rostoucích kalusech mrkve (Daucus carota). V současné době se tato metoda využívá zejména v experimentech zaměřených na zhodnocení vlivu sacharózy v mediu na snížení rychlosti fotosyntetických procesů různě starých lístků (Ibaraki 2006, Solanum tuberosum). Měřenými parametry jsou FV/FM nebo PSII, často souběžně s dalšími biofyzikálními indikátory stresu, například PRI – Plant Reflectance Index, jak tomu bylo ve studii Ibaraki et Gupta (2010) zaměřené na zhodnocení účinků krátkodobého radiačního stresu. V poslední době se in vitro kultury používají i jako modelový objekt pro zjištění časoprostorové heterogenity působení toxických látek na funkci fotosyntetického aparátu. Váňová et al. (2009) měřila účinky fluorantenu, polycyklického aromatického uhlovodíku, na fluorometrické parametry hrachu (Pisum sativum). Při aplikaci fluoranthenu byl zjištěn nárůst F0 a pokles hodnot FV/FM a PSII – všechny tyto parametry indikovaly stres ve fotosyntetickém aparátu. 9 Obr. 4. Kalusy Mandevilla splendens s různě starými rozvíjejícími se prýty a kořeny (vlevo) a vizualizace heterogenity fotosyntetických procesů pomocí metody chlorophyll fluorescence imaging uvedená v nepravých barvách spektra. Vysoké hodnoty jednotlivých parametrů jsou představovány oranžovou a červenou barvou), nízké hodnoty pak zelenou, modrou až tmavě modrou. Potenciální fotosyntetické procesy jsou zobrazeny ve středním panelu pomocí parametru FV/FM, aktuální fotosyntetické procesy v pravém panelu pomocí kvantového výtěžku fotosyntetických procesů v PS II (PSII). Je zřejmé, že fotosyntetické procesy jsou nejvíce stimulovány v kalusech, respektive jejich částech. Studium vlivu patogenů a mykorhizních hub Využití metody indukované fluorescence chlorofylu pro studium vlivu patogenů či mykorhizních hub na fotosyntetické procesy in vitro pěstovaných rostlin se zatím omezuje na specializované práce, nicméně podíl těchto prací v posledních letech narůstá. Jako příklad lze uvést práci Christov et al. (2007), ve které byla sledována odezva rostlin révy vinné (Vitis vinifera) na inokulaci virovým patogenem svinutky (GLRaV-3). Byl zjištěn nárůst hodnot nefotochemického zhášení fluorescence chlorofylu (qN), který bývá spojován s aktivací ochranných protistresových mechanismů v pletivech infikované rostliny. Výhodou této metody je fakt, že lze indikovat časné fáze působení stresu na fotosyntetický aparát, i když nejsou ještě viditelné jakékoliv makroskopické příznaky poškození listu. Další skupinu prací, které využívají metodu fluorescence chlorofylu v in vitro pěstovaných a inokulovaných rostlinách, lze charakterizovat jako řízenou kolonizaci mykorhizní houbou, tedy dodání mykorhizního partnera do in vitro kultivačního prostředí. Pomocí fluorescence chlorofylu je zjišťován vliv kolonizace mykorhizní houbou na fotosyntetické procesy. Tento přístup využívá inokulaci houbou Glomus sp. a byl uplatňován například u rostlin Fragaria vesca (Hernández-Sebastiá et al. 1999) a Prunus persica Borkowska et al. (2008). 10 Přenos rostlin z in vitro do ex vitro podmínek Změna fyzikálně-chemického prostředí při přenosu rostlin z in vitro do ex vitro podmínek je natolik závažná, že většina rostlin omezuje svůj růst, dokud se nepřizpůsobí novým podmínkám, zejména snížené vlhkosti vzduchu a zvýšeným hodnotám fotosynteticky aktivního záření. Tento pokles růstu, respektive rychlosti fyziologických procesů, které se na něm podílejí, lze dokumentovat poklesem fotosyntetické aktivity v asimilačních orgánech. Vhodným měřeným parametrem je základní fluorescenční poměr FV/FM, který klesá v důsledku stresu způsobeného změnou růstového prostředí. Míra a délka trvání tohoto poklesu oproti hodnotám získaných u in vitro rostlin je druhově závislá. Zpravidla je zaznamenán pokles trvající jednotky dnů až týdnů (např. Matysiak 2004). Hsu (2007) uvádí, že tento pokles trvá 1-2 týdny a u vitálních rostlin se FV/FM zcela navrací k původním hodnotám naměřeným v období před vylahvováním až po 3 týdnech. Rostliny, u kterých je zaznamenán rychlý návrat hodnot FV/FM, pak v následném období pěstování v ex vitro podmínkách vykazují zpravidla vyšší rychlost růstu a produkce biomasy. Rychlost aklimace na ex vitro podmínky se ještě zvýší, jsou–li experimentální rostliny několik dní před přenesením z in vitro do ex vitro ovlivněny mírně zvýšenou hodnotou ozářenosti a doplňkem sacharózy (Kadleček et al. 2001, Van Huylenbroeck, J.M., Debergh 1996, Serret et al. 2001a). I když přídavek sacharózy zvyšuje vitalitu a zlepšuje jejich aklimaci na ex vitro podmínky, přináší zpravidla pokles primárních fotosyntetických procesů (FV/FM) – Fuentes et al. 2005, Cassana et al. 2010. Aklimaci v ex vitro podmínkách urychluje rovněž exogenní aplikace některých látek, například antirespirantů. Tento přístup byl uplatněn v práci Pospíšilová et al. (2009). Aplikace ABA bezprostředně po převodu z in vitro do ex vitro podmínek vedla k nárůstu hodnot fotochemického zhášení (qP). Rovněž pro sledování reakce na tato ovlivnění může posloužit dlouhodobé měření základního fluorescenčního poměru FV/FM před přenosem do ex vitro podmínek a bezprostředně po něm. Bezprostředně po přenosu do ex vitro podmínek se mohou na asimilačních orgánech projevit příznaky fotoinhibice fotosyntézy. Kromě poklesu hodnot FV/FM je takový stav charakterizován i poklesem kvantového výtěžku fotochemických procesů ve fotosystému – PSII a nárůstem nefotochemického zhášení fluorescence chlorofylu - qN (Carvalho et al. 2001). Změny hodnot různých parametrů fluorescence chlorofylu mohou dostatečně citlivě indikovat vliv některých faktorů, které zvyšují úspěšnost přenosu z in vitro do ex vitro podmínek. Počítáme mezi ně například ovlivnění zvýšenou koncentrací CO2 (Pospíšilová et al. 1999) v ex vitro podmínkách nebo zvýšením ozářenosti v období bezprostředně před přenosem z in vitro do ex vitro podmínek (Semorádová et al. 2002). SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY Borkowska B., Balla I., Szucs E., Michalczuk B. (2008): Evaluation of the response of micropropagated peach rootstock 'Cadaman' and cv. 'Cresthaven' to mycorrhization using chlorophyll a fluorescence method. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 16: 243- 260. Cassana F.F., Falqueto A.R., Braga E.J.B., Peters J.A., Bacarin M.A. (2010): Chlorophyll a fluorescence of sweet potato plants cultivated in vitro and during ex vitro acclimatization. Brazilian Journal of Plant Physiology, 22: 167-170. Carvalho L.C., Osório M.L., Chaves M.M., Amâncio S. (2001): Chlorophyll fluorescence as an indicator of photosynthetic functioning of in vitro grapevine and chestnut plantlets under ex vitro acclimatization. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 67: 271-280. 11 Dubová J. (2010): Inovace kultivace rostlinných explantátů ve výuce předmětu Bi6120 Rostlinné explantáty a návazných předmětů. Závěrečná zpráva projektu FRVŠ 2362/2009. Masarykova univerzita, 8 s. Farquhar G.D., Caemmerer S., Berry J.A. (1980): A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta, 149: 78-90. Farquhar G.D., von Caemmerer S., Berry J.A.: (2001): Models of Photosynthesis. Plant Physiology, 125: 42-45. Fila G., Badeck F.W., Meyer S., Cerovic Z., Ghashghaie J. (2006): Relationships between leaf conductance to CO2 diffusion and photosynthesis in micropropagated grapevine plants, before and after ex vitro acclimatization. J. Exp. Bot., 57: 2687-95. Fuentes G., Talavera C., Oropeza C., Desjardins Y., Santamaria J.M. (2005): Exogenous sucrose can decrease in vitro photosynthesis but improve field survival and growth of coconut (Cocos nucifera L.) in vitro plantlets. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Plant, 41: 69-76. Genoud C., Coudret A., Amalric C., Sallanon H. (1999): Effects of micropropagation conditions of rose shootlets on chlorophyll fluorescence. Photosynthetica, 36: 243-251. Hernández-Sebastià C., Piché Y. Desjardins Y. (1999): Water relations of whole strawberry plantlets in vitro inoculated with Glomus intraradices in a tripartite culture system. Plant Science, 143: 81– 91. Hsu B.-D. (2007): On the possibility of using a chlorophyll fluorescence parameter as an indirect indicator for the growth of Phalaenopsis seedlings. Plant Science, 172: 604–608. Huang L.C., Weng J.-H., Wang C.-H., Kuo C.-I., Shieh Y.-J. (2003): Photosynthetic potentials of in vitro-grown juvenile, adult, and rejuvenated Sequoia sempervirens (D. Don) Endl. Shoots. Bot. Bull. Acad. Sin., 44: 31-35. Christov I., Stefanov D., Velinov T., Goltsev V., Georgieva K., Abracheva P., Genova Y., Christov N. (2007): The symptomless leaf infection with grapevine leafroll associated virus 3 in grown in vitro plants as a simple model system for investigation of viral effects on photosynthesis. Journal of Plant Physiology, 164: 1124–1133. Ibaraki, (2006): Evaluation of photosynthetic capacity in micropropagated plants by image analysis. In: S.D. Gupta, Y. Ibaraki (eds.): Plant Tissue Culture Engineering. Springer, Dordrecht, the Netherlands, 15-29. Ibaraki Y., Gupta S.D. (2010): Nondestructive evaluation of the photosynthetic properties of micropropagated plantlets by imaging photochemical reflectance index under low light intensity. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 46: 530–536. Kadleček P., Tichá I., Haisel D., Čapková V., Schäfer C. (2001): Importance of in vitro pretreatment for ex vitro acclimatization and growth. Plant Science, 161: 695-701. Lazár D. (2009): Modelling of light-induced chlorophyll a fluorescence rise (O-J-I-P transient) and changes in 820 nm-transmittance signal of photosynthesis. Photosynthetica, 47: 483-498. Matysiak B. (2004): Effect of light intensity on growth and chlorophyll fluorescence of Rhododendron microcuttings during acclimatisation. Folia Horticulturae, 16: 107-114. Maxwell K., Johnson N.G. (2000): Chlorophyll fluorescence - a practical guide. J. Exp. Bot., 20: 659- 668. Millan-Almaraz J.R., Guevara-Gonzalez R.G., Romero-Troncoso R.J., Osornio-Rios R.A., TorresPacheco I (2009): Advantages and disadvantages on photosynthesis measurement techniques: A review. African Journal of Biotechnology, 8: 7340-7349. Muñoz-Muñoz A.C., Gutiérrez-Pulido H., Rodríguez-Domínguez J-R., Gutiérrez-Mora A., RodríguezGaray B., Cervantes-Martínez J.(2007): Analysis of laser-induced fluorescence spectra of in vitro plant tissue cultures. Applied Optics, 46: 2138-2142. Omasa K. (1996) Image diagnosis of photosynthesis in cultured tissues. Acta Hort. 319: 653-658. Pedrós R., Moya I., Goulasb Y., Jacquemoud S. (2008): Chlorophyll fluorescence emission spectrum inside a leaf. Photochem. Photobiol. Sci., 7: 498–502. Pospíšilová J., Synková H., Haisel D., Čatský J., Wilhelmová N., Šrámek F. (1999): Effect of elevated CO2 concentration on acclimation of tobacco plantlets to ex vitro conditions. Journal of Experimental Botany, 50:119-126. Pospíšilová et al. (2009): Effect of abscisic acid on photosynthetic parameters during ex vitro transfer of micropropagated tobacco plantlets. Biologia Plantarum, 53: 11-20. 12 Roháček K., Barták M. (1999): Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica, 37: 339-363. Roháček K., Soukupová J., Barták M. (2008): Chlorophyll fluorescence: A wonderful tool to study plant physiology and plant stress. In: B. Schefs (ed.): Plant Cell Compartments – Selected Topics. Research Signpost, Kerala Publishers, India, p. 41-104. Romano A., Strasser R.J., Eggenberg P., Martins-Loução M.A. (1996): Mycorrhization of cork oak micropropagated plantlets: its vitality during acclimatization measured with fast fluorescence techniques. In: C. Azkon-Aguilar, J.M. Barea (eds.): Mycorrizas in integrated systems from genes to plant development: proceedings of the fourth European Symposium on Mycorrizas. Brussels; Luxemburg. Róth M., Dubová J., Barták M., Rotkovská J.(2010): Zkušenosti s kultivací explantátů v bioreaktorech RITA®. In: M. Barták, J. Hájek, J. Dubová (eds.): Workshop: Rostlinné biotechnologie Současné trendy ve výuce a výzkumu. Sborník příspěvků. Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Brno, ISBN 978-80-210-5382-3, s. 29-33. Semorádová Š., Synková H., Pospíšilová J. (2002): Responses of tobacco plantlets to change of irradiance during transfer from in vitro to ex vitro conditions. Photosynthetica, 40: 605-614. Serret M.D., Trillas M.I., Matas J., Araus J.L. (2001a): The effect of in vitro culture conditions on the pattern of photoinhibition during acclimation of Gardenia plantlets to ex vitro conditions. Photosynthetica, 39: 67-73. Serret M.D., Trillas M.I., Matas J., Araus J.L. (2001b): The effect of photoautotrophy on photosynthesis and photoinhibition of Gardenia plantlets during micropropagation. Photosynthetica, 39: 245-255. Smith M.A.L. (1995): Image analysis for plant tissue culture and micropropagation. In: J. Aitken Christie, T. Kozai, M.A.L. Smith (eds): Automation and environmental control in plant tissue cultures. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 145–163. Stirbet A., Govindjee (2011): On the relation between the Kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and Photosystem II: Basics and applications of the OJIP fluorescence transient. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 104: 236-257. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Srivastava A. (2004): Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient. In: G.C. Papageorgiou, Govindjee (eds.): Chlorophyll a fluorescence: A signature of photosynthesis, Springer, Dordrecht, 321-362. Swain S.S., Tripathy T., Pradipta K. Mohapatra P.K., Chand P.K. (2010): Photosynthetic and transpiration responses of in vitro-regenerated Solanum nigrum L. plants to ex vitro adaptation. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 46: 134-141. Van Huylenbroeck J.M., Debergh P.C. (1996): Impact of sugar concentration in vitro on photosynthesis and carbon metabolism during ex vitro acclimatization of Spathiphyllum plantlets. Physiologia Plantarum, 96: 298–304. Váňová M., Kummerová M., Klemš M., Zezulka S. (2009): Fluoranthene influences endogenous abscisic acid level and primary photosynthetic processes in pea (Pisum sativum L.) plants in vitro. Plant Growth Regul. 57: 39–47. Zanandrea I., Bacarin M.A., Schmitz D.D., Braga E.J., Peters J.A. (2006): Chlorophyll fluorescence in in vitro cultivated apple. Rev. Bras. Agrociencia – Pelotas, 12: 305-308.