Metody rostlinné taxonomie Molekulární metody v botanice Polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction) Důmyslná metoda pro zmnožení (amplifikaci) známé sekvence. Trocha historie 1979-Kary B. Mullis objevil principy PCR 1985 - popsána samotná PCR 1993 - Nobelova cena za chemii Paradox: 1971 - Dr. K. Kleppe a H.G. Khorana publikovali principy na kterých stojí PCR; jejich nápad však zapadl Termostabilní DNA polymeráza PCR : Polymerase Chain Reaction 30 -TirniTnTiwrrnnrrri i niinn.....rnnrimiirTiTinnTT^^ 40 cycles of 3 steps : Step 1 : denatui alien ! minut 94 °C 5" nriTiTrrnTnri l m i rmi i ihm, n i i ii .itttttttttttttttttttttttt^^ ? 3-Jl 1,, 3 3'UllJllUlJllllllS' Step 2 : annealing 45 seconds 54 °C forward and reverse primers!!! '![™ni™Vll'^|n^[™T1TjiS 1 1 s 1 ' 'S 'v> ~ ' " 1 v 1 1 / ' v "'s v 1"''- r /1 >1 ^ 7 5^ Step 3 : extension 2 minutes 72 °C only dNTP's PCR : Polymerase Chain Reaction 30 -40 cycles of 3 steps : \ i / Step 1 : denaturation 1 minut 94 °C %rrmMnnTinwr^^ ........$ 3i j y Step 2 : annealing 45 seconds 54 CC forward and reverse 5' primers!!! ^ nrnTTirrTTTTTTTT 2 minutes 72 °C only dNTP's ■ wanted gene ■ <^ Xjith cycle . —— cycle Lft cycle _ -- 1 = suma 20 Ml PCR program 1x 30x 4°C 94°C 94°C 56°C 72°C forever 2 min 30 sek 30 sek 30 sek Molekulární metody odvozené od PCR Metoda Známá cílová sekvence Počet primerů Specifita primeru Charakteristika metody MAAP RAPD NE l NE Krátký primer (9-11 pb) AP-PCR NE l NE Krátký primer (18-32 pb) DAF NE l NE Krátký primer (5-8 pb) AFLP NE 2 ANO Ligace adaptorů Sekvenování ANO l+l ANO Fluorescenčně značené ddNTP Mikrosatelity ANO 2 ANO Tandemové repetice MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling); RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA); AP-PCR (Arbitrarily Primed- Polymerase Chain Reaction); DAF (DNA-Amplified Fingerprinting); AFLP (Amplified Fragment Lenth Polymorphism) Molekulární metody množství znaků u roven polymorfizmu Opakovatelnost pracnost náklady Izoenzymy RFLP RAPD AFLP Střední Malá Velké Střední Velká Velká Velké Střední Velké Střední Velká Malá Střední Malé Střední Malé Střední Mikrosatelity Velké Velké Velká Malá PCR- sekvencování Malé-Velké Velká Malá-Velká Elektroforéza - separace DNA DNA má záporný náboj díky fosfátovým skupinám Agarózový gel Pufr TBE vs. TA E < Q n C/) o Q_ >(Ď E C/D El. proud kratší (lehčí) fragmenty jsou pohyblivější než delší fragmenty Elektroforetogram Pb 10 000-4 000-3 000- 2 000-1 550- 1 000-750- 500- 400-300- 200- 100-50- vm 1 VM - velikostní marker 1 - genomová DNA 2, 3- DNA fragmenty Vizualizace DNA na DNA se naváže fluorescenční barvivo: které po osvícení UV zářením fluoreskuje.