Vítězslav Bryja Buněčné regulace I Základní morfogenetické dráhy Vlastnosti buněk v průběhu embryonálního vývoje * Rychlé buněčné dělení * Dynamické změny diferenciačního stavu (cell fate) * Intenzivní migrace * Změny tvaru a velikosti buňky * Schopnost odpovědi na poškození = Vlastnosti buněk v průběhu dynamické homeostázy Role signálních drah v regulaci dynamických procesů a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) Hlavní signální dráhy – velká pětka ruka Transkripční faktory * Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Wnt (Wingless/Int) Wingless Int-1 Výsledek obrázku pro wingless drosophila Výsledek obrázku pro int-1 mmtv WNT •Roel Nusse Wnt (Wingless/Int) - rodina ligandů - 19 genů pro proteiny Wnt u člověka a u myši - extracelulární proteiny modifikované glykosylací a palmitoylací - působí na krátké vzdálenosti, váží se k extracelulární matrix - pouze u mnohobuněčných živočichů kanonická dráha /závislá na β-kateninu/ (např. Wnt-1 or Wnt-3a) nekanonická dráha /na β-kateninu nezávislá/ (např. Wnt-5a) Wnt/β-kateninová dráha (= kanonická dráha) - indukuje duplikaci tělní osy u Xenopus - indukuje transformaci buněčné linie odvozené od lidských prsních epiteliálních buněk C57mg - signál přenášen přes translokaci b-kateninu do jádra - 29836_1_two_mind_tadpole_BIL110809 Speciální buněčný aparát pro sekrece Wnt proteinů Kanonická signální dráha Wnt Kanonická signální dráha Wnt - legenda k obrázku: Frizzled – klíčový receptor signálních drah Wnt Lrp5/6 – stěžejní ko-receptor kanonické signální dráhy Wnt Lrp5/6 – stěžejní ko-receptor kanonické signální dráhy Wnt destruction complex Destrukční komplex pro beta-katenin destruction complex destruction complex destruction complex destruction complex destruction complex Destrukční komplex A working model for the destruction complex. (1) Initially, the destruction complex contains Axin, GSK3, CK1 and APC (with the 15 aa and 20 aa repeat regions shown). The complex contains other components such as PP2A, which are not shown here. (2) -Catenin enters the complex by binding Axin and potentially the APC 15 aa repeats. This positions the N-terminus of -catenin near CK1 and GSK3. (3) CK1 phosphorylates -catenin at Ser45. (4) GSK3 phosphorylates -catenin at, successively, Thr41, Ser37 and Ser33. (5) The 20 aa repeats, particularly repeat 3, are phosphorylated by a CK1 (and possibly GSK3) which greatly increases their affinity for -catenin. The binding of a phosphorylated 20 aa repeat to -catenin displaces Axin from -catenin. (6) -TRCP1 binds the phosphorylated N-terminus of -catenin, causing the ubiquitination of -catenin by an E2 ligase. APC is then either desphosphorylated within the complex, allowing the ubiquitinated -catenin to leave the complex, or the ubiquitinated -catenin bound to APC leaves the complex and is separated from APC at the proteasome. The complex then returns to Step 1 - legenda k obrázku destrukčního komplexu: Kanonická signální Wnt dráha - video Familiární adenomatózní polypóza * zkráceně FAP, je autozomálně dominantní dědičné onemocnění tlustého střeva s výskytem četných (tisíce) polypů a adenomů, které později malignizují. Onemocnění způsobuje zmutovaný gen APC Výsledek obrázku pro familial adenomatous polyposis Familiární adenomatózní polypóza Geny pod kontrolou Wnt dráhy v kmenových buňkách Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami •Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy • • Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami •Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy •Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě •R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy • • Vazba R-spondinu na LGR5 aktivuje Wnt dráhu Výsledek obrázku pro lgr5 and rspo Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami •Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy •Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě •R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy •Wnt signalizace jako klíčová složka komunikace mezi kmenovými buňkami a jejich nikou •Inhibitory Wnt dráhy - RNF43/Znrf3 – jako cíle kontrolované R-spondiny • • Vazba R-spondinu na LGR5 aktivuje Wnt dráhu … … díky internalizaci E3-ubikvitin ligáz ZNRF3/RNF43 Výsledek obrázku pro lgr5 and rspo RNF43 je specializovaná E3 ubikvitin ligáza pro Frizzled (FZD) Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami •Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy •Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě •R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy •Wnt signalizace jako klíčová složka komunikace mezi kmenovými buňkami a jejich nikou •Inhibitory Wnt dráhy - RNF43/Znrf3 – jako cíle kontrolované R-spondiny •R-spondin jako klíčový faktor potřebný pro růst organoidů • • Výsledek obrázku pro wnt in paneth cells * Výsledek obrázku pro wnt in paneth cells Epitelo-mesenchymální přechod (EMT – epithelio-mesenchymal transition) Epiteliální - mezenchymální přechod (EMT) je proces, při kterém epitelové buňky ztratí svoji buněčnou polaritu a adhezi buněčných buněk a získají migrační a invazivní vlastnosti, stanou se mezenchymálními. EMT je nezbytný pro četné vývojové procesy včetně tvorby mezodermu a tvorby neurální lišty. EMT se uplatňuje při hojení ran, při orgánové fibróze a při iniciaci metastáz v progresi rakoviny. Beta-catenin se v buňkách vyskytuje ve dvou hlavních „poolech“ – biochemických komplexech 9_wnt 1. Jako součást Wnt signalizace 2. V komplexu s E-cadherinem jako součást „adherens junctions“ Epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) v nádorech Wnt signální dráha určuje předozadní osu i při regeneraci u ploštěnky Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Hedgehog dráha •hedgehog (Hh) u octomilky – název „ježek“ podle fenotypu larvy •u savců jsou tři homology: • sonic hedgehod (Shh) •indian hedgehog (Ihh) •desert hedgehog (Dhh) hedgehog in Drosophila Sonicrun_2006 Sonic the Hedgehog •The hedgehog gene (hh) was first identified in the fruit-fly Drosophila melanogaster in the classic Heidelberg screens of Christiane Nüsslein-Volhard and Eric Wieschaus, as published in 1980. These screens, which led to them winning the Nobel Prize in 1995 along with developmental geneticist Edward B. Lewis, identified genes that control the segmentation pattern of the Drosophila embryos. Schéma Shh dráhy Sonic_hedgehog_pathway •Sonic hedgehog (SHH) je modifikován oxysterolem a pro sekreci vyžaduje protein Dispatched (Disp) •Shh váže Patched (PTCH), který je za normálních okolností inhibitorem Smoothened (SMO), po vazbě Shh je tato inhibice přerušena •Uvolnění SMO umožňuje aktivaci transkripčních faktorů z rodiny GLI, které se přesouvají do jádra a spouští transkripci •legenda k obrázku: Sonic hedgehog (SHH) is translated as a ~45kDa precursor and undergoes autocatalytic processing to produce an ~20kDa N-terminal signaling domain (referred to as SHH-N) and a ~25kDa C-terminal domain with no known signaling role (1 on figure 5). During the cleavage, a cholesterol molecule is added to the carboxyl end of the N-terminal domain, which is involved in trafficking, secretion and receptor interaction of the ligand. When SHH reaches its target cell, it binds to the Patched-1 (PTCH1) receptor(3). In the absence of ligand, PTCH1 inhibits Smoothened (SMO), a downstream protein in the pathway(4). It has been suggested that SMO is regulated by a small molecule, the cellular localisation of which is controlled by PTCH. PTCH1 has a sterol sensing domain (SSD), which has been shown to be essential for suppression of Smo activity. A current theory of how PTCH regulates SMO is by removing oxysterols from SMO. PTCH acts like a sterol pump and remove oxysterols that have been created by 7-dehydrocholesterol reductase. Upon binding of a Hh protein or a mutation in the SSD of PTCH the pump is turned off allowing oxysterols to accumulate around SMO.This accumulation of sterols allows SMO to become active or stay on the membrane for a longer period of time. The binding of SHH relieves SMO inhibition, leading to activation of the GLI transcription factors(5): the activators Gli1 and Gli2 and the repressor Gli3. The sequence of molecular events that connect SMO to GLIs is poorly understood. Activated GLI accumulates in the nucleus(6) and controls the transcription of hedgehog target genes(7). Schéma Shh dráhy Shh – učebnicový morfogen Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh Shh = jeden z nejlépe popsaných klasických morfogenů (tzv. model francouzské vlajky) – v závislosti na koncentraci morfogenu se spouští odlišné transkripční programy Limb_bud Shh Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Přirozené inhibitory Shh dráhy veratrum_album cyclopia cyclopamin – teratogenní alkaloid z kýchavice (Veratrum californicum), poprvé identifikován jako látku způsobující cyklopii (= 1 oko) a holoprosencephalii u ovcí Expression of Sonic hedgehog (Shh) protein and the determination of the midline structure in mouse embryo. An SEM micrograph of the frontal view of a mouse embryo (fetal age 7.75 days). Shh protein is green. The dotted line in the micrograph shows the region: Shh antibody reveals Shh. The part that will become the brain (head fold) is followed by the perchordal plate. Shh (in green) that is expressed in the prechordal plate induces midline structure formation. Model mice with Holoprosencephaly due to a Sonic Hedgehog (Shh) deficiency. An SEM micrograph of ten-day old mouse embryos (front view of face). The mouse deficient in Shh gene (right) has no midline structure and only one region (eye position shown in green). Note, too, the lack of nostril separation due to no midline structure. The normal embryo (left), by contrast, has both the eyes and nostrils separated to between the two hemispheres. Hedgehog (Hh) dráha je vázána na primární cilie •Abnormální Hh/Wnt a s nimi spojená onemocnění jsou způsobena defekty ve tvorbě primárních cilií (infertilita, polydaktylie, polycystické ledviny, degenerace retiny). •Hh je přímo vázán na primární cílie. Primary cilia vs. motile (secondary) cilia •struktura 9+2 •pohyblivé •epitely tracheje, vejcovodů, ependym… • • •struktura 9+0 •nepohyblivé •téměř všechny buňky (www.primary–cilium.co.uk) •solitérní • fig006rsc 505px-Eukaryotic_cilium_diagram_en_svg PRIMÁRNÍ SEKUNDÁRNÍ Primární cilie - funkce •délka 2-10µm, průměr 0.25µm • •chemo- a osmosenzory •fotoreceptory •mechanoreceptory • •komunikace v extracelulární matrix • •nodální cilie –pohyblivá –blastocysta –pravolevá souměrnost – •model trandukce – receptory iontové kanály, efektorové proteiny, transkripční faktory Primary cilia (blue) emerging from the cells of a mouse embryo (green). Intraflagelární transport (IFT) •Poprvé popsali Kozminski et al. 1993 pomocí DIC mikroskopie •Za transport zodpovědný kinesin-II – transport k distálnímu „+“ konci a dynein zodpovědný za transport k „-“ konci. •Kif3A, Kif3B (podjednotky kinesinu) KO buňky netvoří cilie. •IFT je zodpovědný za regulaci signálních drah vázaných na primární cilie • Primární cilie a Hh signalizace •Je spojen s primárními ciliemi •Ligand se naváže na patch (Ptc) protein, což způsobí zrušení inhibičního efektu Ptc na protein smoothened (Smo), který transdukuje signál přes glioma transkripční faktory (Gli) do jádra, kde řídí expresi Hh genů. (Gli1, Gli2 a Gli3A jsou aktivátory a Gli3R je represor). Hlavním represorem je SuFu. •IFT hraje klíčovou úlohu ve funkci regulace Hh signální dráhy (spojuje Smo a Gli) • •Mutace Kif3A a Kif3B mají podobné fenotypy v důsledku ztráty cilie. Primární cilie a Hh signalizace: důkaz cilia and hedgehog tumors Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Basal cell carcinoma – způsobena aktivací Smoothened Primární cilie a Hh signalizace: důkaz cilia and hedgehog tumors control Shh active, cilia present Shh active, cilia absent Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Notch •Notch=zářez – podle prvního fenotypu octomilky se zářezy na křídlech (T.H. Morgan, 1919) notch Drosophila Transmembránové heterodimerické receptory Notch 1-4 Notch ligandy Jagged a Delta – jsou vázány na buněčný povrch Notch Notch dráha - overview Notch scheme •Vazba ligandu Notch receptor aktivuje dvě proteázy (enzymy specificky štěpící protein) •Proteázy jsou z rodiny ADAM a gamma-sekretáz •Štěpení Notch těmito proteázami uvolňuje tzv. NICD (Notch intracellular domain), který se uvolňuje a do cytoplazmy a následně přesouvá do jádra •NICD přímo interaguje s transkripčními faktory CBF1/Mastermind a spouší transkripci Notch dráha - biologie Notch scheme •Díky přímému působení má význam zejména při diferenciaci •Typicky např. „Binary decisions“ a laterální inhibici •Role v nikách kmenových buněk nebo při angiogenezi Nika zárodečných kmenových buněk (Caenorhabditis elegans) * https://www.stembook.org/node/497 Laterální inhibice – proces, který zajistí, že dvě sousedící buňky nebudou mít stejnou buněčnou identitu (fate); díky signálním drahám (např. Notch), které díky přímému kontaktu zajistí odlišnost sousedících buněk * https://www.stembook.org/node/497 Nika zárodečných kmenových buněk (Drosophila melanogaster) Nika kmenových buněk ve střevě Výsledek obrázku pro BMP and intestinal stem cells Notch dráha – role v angiogenezi •Viz další přednáška Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka TGF/BMP • TGF – transforming growth factor (transformující růstový faktor) • BMP – bone morphogenetic protein (kostní morfogenetický protein) • • patří do TGFb nadrodiny 1.TGFb1-3 2.BMPs – 20 různých ligandů 3.GDF (growth differentiation factor): 9 ligandů 4.activin/inhibin/nodal TGFb nadrodina má následující podrodiny: TGF beta nadrodina: Společným znakem je signalizace přes: - konzervativní rodinu Ser/Thr kinázových receptorů – jsou dvou typů a po vazbě ligandu dimerizují - cytoplazmatická signalizace přes tzv. SMAD proteiny Signální dráha BMP BMP_signaling_pathway Inhibitory BMP faktorů •noggin •chordin (Chd) •sklerostin chordin vs chordin vs Přímá fyzická interakce mezi chordinem a BMP je podstatou inhibičního působení chordinu jsou klíčové pro fyziologické funkce BMP Klíčová role BMP inhibitorů produkovaných notochordem při indukci nervové ploténky neurulation+notochord notochord (= chorda) produkuje faktory, které specifikují ektoderm a vedou ke tvorbě nervové ploténky (neural plate). Jde zejména o následující faktory: noggin, chordin a follistatin (inhibitory BMP a aktivinu). BMP signalizace přímo antagonizuje Wnt ve střevní kryptě Výsledek obrázku pro BMP and intestinal stem cells - Noggin (inhibitor BMP) je spolu s Wnt, R-spondinem a EGF základní složkou média pro kultivaci organoidů Integrace signálů vede k homeostáze Výsledek obrázku pro noggin intestinal crypt Další zajímavé proteiny z BMP rodiny Myostatin (GDF8) – regulátor diferenciace svalu Výsledek obrázku pro myostatin GDF8 (myostatin) – příklad tzv. master regulátoru konkrétní tkáně post-7-57588-MyostatinDog2 bull myostatin man whippet Belgian blue