Buněčný cyklus Jan Šmarda Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Přednáška kurzu Molekulární biologie e u kary ot 10.11. 2019 Co je buněčný cyklus? opakovaný proces růstu a dělení buněk podléhá regulačním signálům z okolí buněk: • mitogenním signálům (růstovým faktorům) • antimitogenním signálům (např. TGF-(3) - zastavují cyklus za přítomnosti mitogenních faktorů • signálům vedoucím buňku do postmitotického stavu (návrat k proliferaci nevratně znemožněn) nebo vratné klidové fáze GO podléhá signálům z vnitřního prostředí buňky: • celistvost genomu • metabolismus mnohobuněčné organismy: sladění s vývojem, homeostáze, průběžná obměna buněk Vnímavost buněk vnější svět monitorován receptory na základě signálů buňka činí zásadní rozhodnutí: - proliferovat/neproliferovat - diferencovat/nediferencovat - migrovat/nemigrovat - žít/nežít growth factor receptors monitors of genome integrity I_ monitors TGF-ß of cell receptors integrins metabolism J J J L OR enter into enter into at active W cell cycle quiescent state Figure 8.1 Th* Biology ol Canter (C land SotiKt 20U) 1 programming of cell cycle phases rrVi Gi — S — G2 ■*■ M Buňka po svém vzniku: Co dál? mitóza a cytokineze dokončeny pokračovat dalším cyklem růstu a dělení nebo přejít do klidové fáze GO? rozhoduje přítomnost mitogenních/antimitogenních faktorů některé buňky opouštějí cyklus trvale a rezignují na další růst a dělení: stávají se postmitotickými Hlavní procesy cyklu: růst a dělení rust: • budování nitrobuněčného obsahu • syntéza a hromadění buněčných složek • zvětšování objemu • duplikace buněčného genomu dělení: mitóza + cytokineze DOCTOR FUN presents BLOBS M0M ? OA) ? The heartbreak of mitosis blobs-047 I II T3 — tí K ■2 S it •g Li_ ^ "ŕ >5 SI sQ SI © tí it |« li 1-1 3° °- CL " !°1 I ^ t fppt.com 5 Replikace DNA u p roka ryot zacina okamžité po dokončeni cytokineze Cell elongates and DNA is replicated Cell wail and plasma membrane begin to divide Cross-wall forms completely around divided DNA Q Cells separate Celt wall Plasma membrane f {a) A diagram of the sequence of cell division. > dna Partially Cell wall (nuclear formed area) cross-wall (b) A thin section of a cell of Bacillus licbenifornils starting to divide. lion IrVJ , pLÍJ:3lmig SS Etar^amin Cunirninrjü. fppt.com 6 Replikace DNA u eukaryot po dokončení cytokineze se okamžitě zahájí syntéza RNA a proteinů, replikace DNA se odkládá (často na 12 - 15 hodin: fáze Gl) • prodleva souvisí s rozhodováním o dalším osudu buňky • pokračovat v růstu a cyklování? • přejít do klidového stádia? • pokud do klidového stádia, diferencovat se nebo ne? Diagram fází buněčného cyklu JOOl vsc fppt.com 7 Časová náročnost S fáze u savčích buněk v kultuře obvykle 6-8 hodin u různých buněčných typů probíhá různě rychle nejrychleji u embryonálních buněk a lymfocytů, kde celý cyklus netrvá déle než 5 hodin u člověka je třeba replikovat 6,4 x 109 párů bází na diploidní genom % s # Early embryonic cell cycle Somatic cell cycle fppt.com 8 Embryonální kmenové buňky(ESC) fppt.com Buněčný cyklus u ESC • vypnuta kontrola ze strany pRb i p53 • nejsou potřebné mitogenní signály z vnějšku, ale buňky si vystačí s nitrobuněčnými signály (např. Ras je konstitutivně aktivní) • reminiscence jednobuněčných organismů, které rostou autonomně -nezávisle na buňkách sousedních • po injekci do dospělých organismů mohou indukovat tvorbu benigních nádorů (teratomů) = jediný případ, kdy tvorbu nádoru dokážou vyvolat buňky divokého typu (nemutované) Fáze G 2 • příprava na vstup do M fáze a buněčné dělení • časové nároky u savčích buněk: 3-5 hodin s M-fáze • k dispozici chromozomy s duplikovanou DNA: sesterské chromatidy kl v . r i v v. i r i . r sobe v jadre přilehají • přesné rozdělení chromatid • genetická výbava dceřiné buňky závisí na přesnosti replikace DNA buňky mateřské v S-fázi a přesnosti segregace duplikovaných chromozomů v M-fázi Co když to nefunguje? striktní požadavky na přesnost cyklu v evoluci vedly k vytvoření kontrolních mechanismů monitoruje se každý krok následná fáze může nastat jen po řádném dokončení fáze předchozí dokončená fáze cyklu nemůže být zopakována jinak než opakováním celého cyklu v případě problémů regulační mechanismy dokážou cyklus pozastavit až do jejich vyřešení Kontrolní body (^checkpoints") • na přechodech fází • zajišťují „kontrolu kvality" cyklu Kontrolní body (^checkpoints^) poškození DNA/chybná replikace: zpomalení nebo zastavení cyklu ve fázi G1/S/G2 buňka nevstupuje do fáze S s poškozenou DNA buňka nevstupuje do fáze M před dokončením replikace DNA nebo s poškozenou DNA buňka nemůže vstoupit do anafáze, dokud nejsou všechny chromozomy řádně sestaveny a připojeny k mitotickému vřeténku tutéž fázi nelze opakovat 2x v rámci téhož cyklu entrance into M blocked if DNA replication is not completed anaphase blocked if chromatids are not properly assembled on mitotic spindle DNA damage checkpoint: DNA replication halted if genome is damaged DNA damage checkpoint: entrance into S is blocked if genome is damaged Figute 8.4 The Biology of Cancer (© Gartand Science 2014) Kontrolní body (^checkpoints^) ATM/R DNA-damage checkpoint P21CP 1 Cyclin A/B-CDK1 / Cdc25C D I Intra-S-phase + checkpoint ATR Spindle-assembly checkpoint Mad2 i APC/C-Cdc20 polyubiquitination of securin \ Anaphase Spindle-position checkpoint APC/C-Cdh1 J polyubiquitination <— Cdc14 —► of B-type cyclins Sid M-phase entry Cyclin D-CDK4/6 ATM/R 1 p53 I p2icip DNA-damage checkpoint S-phase entry Cyclin A-CDK2 T í P21CIP Cdc25A ED 1 DNA-damage pf3 checkpoint ATM/R —► Chk1/2 - Cyclin E/A-CDK2 T í P21CIP Cdc25A í p53 í 23 DNA-damage checkpoint ATM/R Chk1/2 fppt.com Ztráta kontrolního bodu? chaos např. ztráta proteinu Radl7, který je součástí kontrolního bodu bránícího opakované replikaci DNA: endoreplikace chromozomální DNA, zvýšení stupně ploidie Normální lidský karyotyp Lidský karyotyp bez Rad 17 figure 8.5ů The Biology of Cancer 15 Garland Sťiťitíe 2014) Růst nebo být v klidu? • odráží nutnost koordinace se sousedními buňkami při výstavbě tkání (s výjimkou embryonálních buněk) • 1014 tělních buněk nemůže dostat právo autonomního rozhodování o vlastním dělení • buňka vyhodnocuje pro- a protirůstové signály ve svém okolí během specifického okna fáze Gl: od začátku Gl do času 1-2 hodiny před začátkem fáze S • v bodě restrikce musí být učiněno finální rozhodnutí Odebrání séra během 80-90% Gl: - přechod do klidového stavu Odebrání séra během posledních 10-20% Gl: - přechod do fáze S, G2 a M A period during which ^flfi V H cells are responsive to mitogenic GFs R point Figure 8.6 Iht B»o?> m Unter ft GjHjia taMniOH] 1 Totéž platí pro antimitogeny Gl fáze • nejvíce variabilní • buňka citlivá na vnitřní i vnější podněty • rozhodnutí o cyklování učiněné před bodem restrikce se respektuje i ve zbývajících fázích cyklu, i kdyby mezitím došlo ke změně vnější situace • fáze S, G2 a M probíhají podle pevného jízdního řádu, který se podstatně nemění ani u buněk nádorových, nereaguje na vnější podněty (na vnitřní ano) • bod restrikce je tak kritickým rozhodovacím okamžikem, zda má buňka růst nebo ne • deregulace bodu restrikce: rakovina Kontrola připojení buňky k matrix • bez řádného přichycení buňky se cyklus zastavuje nebo nastává programovaná buněčná smrt - anoikis („bez domova") • nádorové buňky tento kontrolní bod téměř vždy ztrácejí • některé onkoproteiny (Src/Ras) dokážou obelstít buňku, takže dostává falešné signály, že je přichycená (mechanismus neznámý) Kinázy buněčného cyklu: CDK cyklin-dependentní kinázy: nikdy nefungují samostatně plně závislé na cyklinech CDK ve spojení s cykliny zodpovídají za fosforylaci substrátů zajišťujících funkce jednotlivých fází cyklu ukončení aktivity komplexu cyklin/CDK ukončuje příslušnou fázi Cydin *^ Target protein CDK y Cydin CDK Cydjn inactive Cyctin CDK active CDK > CDK Cyciin binds and activates CDK CDK activates target protein to reguíate cefi cycle Cyciin destroyed CDK fosforylují desítky až stovky molekul zodpovědných za chod cyklu Ssart of M phase L ■ ■ . ■ ■ Í G2/M-phase cyclin G2/M-phase CDK CDK ~7 Degradation of í? G2/M-phasecydin Degradation of S-phase cyclin S-phase CDK ^^^^^ E Gl/S-phaseCDK 5-phase progréssion CDK ft " # Start of 5 pfoase S-phase cyclin ? o Degradation of G1 /5-phase cyclin Co jsou CDK? katalytická složka heterodimerních serinových/treoninových kináz regulační složkou jsou cykliny - členové proteinové rodiny s typickou doménou cca 100 AK, která je nutná pro vazbu a aktivaci CDK účinná regulace: vazbou cyklinu A se zvýší enzymová aktivita CDK2 400000x cykliny rozhodují o aktivitě CDK a specifitě substrátů Q Cyclin- larget cvciirjt CDK JÍL protein JĚĚ m ^j|p|P binding Bj ^ binding H Target protein binding t CDK Phosphorylation of target protein CDK: motor buněčného cyklu fáze Gl (do bodu R): řízena kinázami CDK4 a CDK6 spojenými s jedním z cyklinů Dl, D2 a D3 pozdní Gl po bodu R a vstup do S: cykliny El a E2 s kinázou CDK2 fáze S: cykliny A1/A2 nahrazují v kompexu s CDK2 cykliny E pozdní S: cykliny A změní partnera - místo CDK2 se vážou na CDC2/Cdkl fáze G2 a M: nahrazení cyklinů A na CDC2/Cdkl cykliny B (BI a B2) pro případný vstup do G0 je potřeba komplex cyklinů C a CDK3 Table 17-1 The Major Cyclins and Cdks of Vertebrates and Budding Yeast CYCLIN-CDK COMPLEX G,-Cdk G/S-Cdk S-Cdk M-Cdk VERTEBRATES CYCLIN CDK PARTNER BUDDING YEAST CYCLIN CDK PARTNER cyclin D* cyclin E cyclin A cyclin B Cdk4, Cdk6 Cdk2 Cdk2,Cdk1** Cdkl Cln3 Cln1,2 Clb5,6 Clb1,2, 3,4 Cdkl** Cdkl Cdkl Cdkl * There are three D cyclins in mammals (cyclins D1, D2, and D3). ** The original name of Cdkl was Cdc2 in both vertebrates and fission yeast, and Cdc28 in budding yeast. fppt.com B CDC2 I V \ D CDK4/6 CDC2 @> 0 R point A CDK2 liyrtři nwSabril[jwi K 6jib»d S<™ iOHl_ Regulace komplexů cyklin-CD • zajišťuje buňce možnost zásahu do každé části cyklu • hlavní regulační prvek: dostupnost a hladina cyklinů (výrazná fluktuace) • hladina CDK se mění jen minimálně • první experimenty prováděné na raných embryích žab a mořské ježovky: - hladina cyklinu B silně stoupá před začátkem M-fáze, čímž je umožněna tvorba komplexu cyklinů B a CDC2 - na konci M fáze hladina cyklinů B prudce klesá v důsledku jejich řízeného rozkladu - u raných embryí se tak děje u všech buněk současně, hladiny cyklinových proteinů synchronně stoupá a klesá - podklad pro jejich název 25 Kolísání cyklinů • v závislosti na fázi cyklu • hladina cyklinu E je nízká po většinu Gl, prudce stoupá po průchodu bodem R a rychle klesá po zahájení S • hladina cyklinu A se zvyšuje v S fázi • likvidace cyklinů po dokončení jejich mise je následkem polyubikvitinace a proteazomové degradace • rozklad cyklinů zajišťuje jednosměrnost cyklu cyclin B nuclear D1 cyclin E cyclin A R point Figure 8.10 The Biology of Cancer !'-• Garland Science 2014) Degradační systémy • vedle CDK dalšími řídícími elementy cyklu • zajišťují řízený rozklad specifických proteinů cyklu • následkem je nevratný posun fází ubikvitin ligázy související s buněčným cyklem: • SCF • „anaphase promoting complex" = cyklozom (APC/C) • specificky značí proteiny polyubikvitinovou značkou, která je předurčí k proteazomové likvidaci APC-Cdhl/proteasorne degrades mitotic cyclins APC-C*c20/ proteas\me degrade SecLirir Telophase and cytokinesis Anaphase tyelin-CD^ Mitotic cyclin-CDK activates early mitotic events S-phase cyclin-CDK activates pre-replication complexes DNA pre-replication complexes assemble origins G1 cyclin-CDK inactivates Cdh1 G^ cyclin-CDK activates expression of S-phase cyclin CDK components G- cyclin-CDK phosphoryJates S-phase inhibitor SCF/proteasome degrades phosphorylated S-phase cyclin-CDK inhibitor DNA replication 28 Cyklování cyklinů D zřetelné odlišnosti od jiných cyklinů hladina cyklinů D se v průběhu cyklu nemění v pravidelném rytmu, ale v závislosti na mimobuněčných signálech, především mitogenních růstových faktorech o c E u-i o rsl 00 m CM ■4.5 kb ■3.8 kb mitogen CSF-1 (colony-stimulating factor 1) indukuje rychlý nárůst hladiny mRNA pro cyklin Dl u makrofágů (northern blotting, sonda specifická pro cyklin Dl) odstranění CSF-1 vede k rychlému poklesu hladiny cyklinů D (poločas rozpadu = 30 minut) fppt.com 29 Exprese genů pro cykliny D pod kontrolou signálních kaskád cyklin D průběžně informuje aparát cyklu o stavu okolí buňky fppt.com Ftal-GDS GSK-3JÍ growth HER2/Neu Spi Dl ■*-Tcf/Lef — B-catenin -- Frizzled ■*- Wnts factor s STAT Gli NF-kB t t t Jak Smoothened IKK t í Patched t cytokine various receptor ! receptors t t cytokine Hedgehog various ligands Figure 8.11b The Biology of Cancer (© Garland Science 2014) 30 Proč tři varianty cyklinu D? cykliny Dl, D2, D3 mají obdobnou funkci enzymatická aktivita a substrátová specifita komplexu s CDK nezávisí na typu cyklinu D promotor každého z cyklinů D má specifické sekvence, které zajišťují citlivost pro jiné signální dráhy řízené jinými receptory Table 8.1 Induction of D-type cyclin expression by extracellular signals Source of signal RANK receptor Prolactin receptor Estrogen receptor Focal adhesion kinase HER2/Neu receptor Wnts-Frizzled receptor Bcr/Abl FSH receptor Various mitogens lnterleukin-4, 7 receptor lnterleukin-5 receptor Mitogens Signaling intermediaries NF-kB pathway Jak/STAT AP-1 TF (?) E2F and Spl TFs (5-catenin and Tcf/Lef TFs cyclic AMP Myc STAT3/5 E2A TF Type of cyclin Abbreviations: RANK, receptor activator of NF-kB; FSH, follicle-stimulating hormone. Table Ä.1 The Bioloip of Cancer ('ř.-foilaritf Science 2011) fppt.com 31 Cyklin D a funkce nesouvisející s buněčným cyklem ^ spojuje se s estrogenovým receptorem a transkripčním faktorem C/EBPp vazba s ER aktivuje tento receptor podobně jako estrogenový ligand (mitogenní účinek, běžná overexprese cyklinu Dl u ER-pozitivní rakoviny prsu) vazba s C/EBP(3 aktivuje tento transkripční faktor a ten pak ovlivňuje diferenciační procesy v lidském genomu bylo chromatinovou precipitací nalezeno nejméně 700 míst s navázaným cyklinem Dl, většinou spojených s promotory, (pravděpodobně existují další, dosud neznámé funkce cyklinu Dl) fppt.com 32 Vnější řízení buněčného cyklu EGF komplexy cyklinu D a CDK4/6 zajišťují procesy fáze Gl od jejího začátku až po bod R - po tuto dobu je buňka citlivá k mimobuněčným signálům aktivace cyklinu D mitogeny je pod kontrolou signální dráhy MAPK ^ MAP kinase kinase kinase^/; MAP kinase kinase Guanine nucleotide exchange factor p p Receptor tyrosine kinases Cyclin D Transcription MAP kinase (Phosphorylation ] Myc fppt.com Vnitřní řízení buněčného cyklu • po přechodu bodu R se buňka dostává do autonomního modu, přechází na vnitřní řízení následující cykliny jsou pod kontrolou endogenních signálů průběh následujících fází cyklu je tak předvídatelný cykliny dané fáze vypínají expresi cyklinů fáze předchozí PROGRAM INFLUENCED BY EXTRACELLULAR SIGNALS _i_ CELL-AUTONOMOUS PROGRAM _i_ R point CDK4/6 f CDK2 fppt.com Figure 8.12 The Biology of Cancer (©Garland Science 2014) 34 Další roviny řízení cyklu • inhibitory CDK (CKI) • antagonizují působení cyklinů tím, že se vážou na komplexy cyklinů a CDK a tím je inaktivují G»CV\eCK?0^-T- DNA, DAn/\G£ i i Sví G j Dvě rodiny inhibitorů CDK rodina INK4 (inhibitors of CDK4) - pl6INK4A, pl5INK4B, pl8INK4C, pl9INK4D - specificky vážou komplexy CDK4/CDK6 s cyklinem D - neúčinkují na CDC2 a CDK2 rodina Cip/Kip - p21Cipl, p27Kipl a p57Kip2 - inhibice různých typů komplexů cyklin/CDK - ovlivňují i procesy transkripce, apoptózy, diferenciace, buněčné migrace, organizace cytoskeletu INK4A INK4B p18INK4C piglNK4D p16 p15 D-CDK4/6 p57KiP2 p27 Kip1 □ p21° jih 1 I r^^í 1 * m m mam E-CDK2 A-CDK2 A-CDC2 B-CDC2 cyclín Cdk / active cyclin-Cdk complex inactive p27-cyclin-Cdk complex fppt.com 36 TG F p aktivuje pl5INK4B antimitogenní faktor TGF(3 reguluje buněčný cyklus prostřednictvím inhibitorů CDK významně zvyšuje expresi pl5INK4B a mírně rovněž p21Cipl pl5INK4B blokuje tvorbu nových komplexů cyklin D-CDK4/6 a inhibuje aktivitu komplexů již sestavených buňka nemůže projít fází Gl a dosáhnout bodu R TGF(3 prostřednictvím p21Cipl dokáže blokovat funkci i ostatních komplexů cyklin/CDK exposure to TGF-p 0 2 4 6 8 14 hrs >p75//v*4emRNA fppt.COm plasma membrane \ m m CDK2 A- CDC2 B-CDC2 5 14) rnrbolwgyoUjntrr: - kjfljnd 'vimtt JOH.i Poškození DNA aktivuje p21Cip • p21Cipl dokáže blokovat funkci různých komplexů cyklin/CDK • cyklus se zastaviv různých fázích dokud není DNA opravena • gen p21Cipl je pod kontrolou p53 Proteiny Cip/Kip mají další funkce nezávislé na CDK regulují transkripci vazbou na transkripční faktory blokují apoptózu regulují dynamiku aktinového cytoskeletu Transcription p21 - -| E2F-1 p27 — Neurogenin-2 p21 - -\ STAT-3 ' p57 — >- MyoD p21 - —I c-Myc p21 - -| p300/CBP Cytoskeleton p27 -1 RhoA _. + p21 -1 ROCK p57 -1 LIMK (rodent) Cofilin i ■ Actin remodeling + Cell movement Apoptosis p57 p21 V J v JNK/SAPK ASK1/MEKK5 I \ Stress-induced apoptosis p21 1 Procaspase-3 I Caspase-3 I Fas-mediated apoptosis fppt.com 39 Fosforylace CDK další regulační úroveň při řízení buněčného cyklu podmínkou aktivity CDK je fosforylace určitých aminokyselin a defosforylace jiných aminokyselin v blízkosti aktivního místa aktivační fosforylace kinázou CAK (CDK-activating kinase) inhibiční fosforylace katalyzována kinázou Wee 1 CAK je komplex cyklin-CDK, který fosforyluje T-smyčku CDK a tím ji stimuluje k opuštění katalytického místa odstranění inhibičního fosfátu fosfatázou CDC25 cyclin Cdk-activating kinase (CAK) Cdk 1(A) INACTIVE T-loop active site (B) PARTLY ACTIVE activating phosphate (C) FULLY ACTIVE cyclin inhibitory phosphate Weel kinase Cdc25 phosphatase Cdk activating phosphate ACTIVE INACTIVE Fosforylace Rb při přechodu bodu restrikce • nádorový supresor Rb zastavuje cyklus • defektní nebo chybí u retinoblastomů, sarkomů, malobuněčných karcinomů a dalších nádorů • Rb je v průběhu buněčného cyklu fosforylován • nefosforylován v GO • slabě fosforylován (hypofosforylován) na malém počtu serinových a treoninových zbytků po vstupu do Gl • silně fosforylován (hyperfosforylován) na mnohem větším počtu serinových a treoninových zbytků s přechodem bodu restrikce • po zbytek cyklu pRb zůstává v hyperfosforylovaném stavu • po ukončení mitózy se fosfátové skupiny odstraní proteinovou fosfatázou typu I (PPI) Rb: hlídač bodu restrikce • v průběhu rané až střední fáze Gl působí jako inhibitor buněčného cyklu • hyperfosforylace jej inaktivuje, takže ztrácí svou inhibiční funkci, což umožňuje průchod bodem restrikce Co rozhoduje o fosforylaci Rb v rané až střední fázi Gl hypofosforylaci pRb zajišťuje CDK4/6-cyklin D v pozdní fázi Gl hyperfosforylaci zajišťuje CDK2-cyklin E - inaktivace Rb ztráta mitogenů v Gl před dosažením bodu R znamená pokles cyklinu D, Rb ztrácí fosfátové skupiny a mění se na protein, který není dobrým substrátem pro fosforylaci komplexy CDK2-cyklin E D cyclins mitogens -^^J^Qj CDK4/6 Irs \ hypophosphorylated \ unphosphorylated v fppt.com early and mid-Gi I Figuře 8.22 The Biúlogy of Cancer (©Garland Science 2014) hyperphosphorylated K hypophosphorylated late G-| E-CDK2 i 4: Rb po přechodu bodem restrikce • úroveň hyperfosforylace a funkční inaktivace Rb po přechodu R neklesá, ale ještě se posiluje pomocí komplexů CDK s cykliny E, A a B • žádný z nich již není citlivý na mimobuněčné signály: cyklus pokračuje v pevně stanoveném rytmu S - G2 - M • defosforylace pRb po ukončení mitózy proteinovou fosfatázou typu I (PPI) Ztráta Rb? Problémy... • mutace v genu Rb, metylace jeho promotoru, působení onkoproteinů ztráta funkce „ovladače závory" bodu R (zůstává otevřená) • bez dozoru Rb buňky přecházejí z Gl do S bez náležité kontroly • deregulace Rb je velice rozšířená u nádorových buněk (možná k ní dochází úplně ve všech...) Rb a E2F transkripční faktor E2F rozhoduje o transkripci genů nutných pro S fázi a další pokračování cyklu nefosforylovaný/hypofosforylovaný Rb váže E2F hyperfosforylovaný pRb uvolňuje E2F Ft point Gi/S boundary í early/mid Gi late S phase pRb ^^^^ ^^^^ . (E2Fl|vl) 2 í 1 >. _ / Fkgure B.23a The Bm-logyiif Cancer í ■ ■ (l^rland lei rite i*14t Mechanism of Action of Rb (Retinoblastoma) Protein in Cell Cycle Regulation Non-phosphorylated RB Bound to E2F Phosphorylation of Rb Release E2F E2F migrate to nucleus Induce transcription I Cycle I Protein factors for cell cycle progression ^-j Nucleus fppt.com Rb a E2F raná fáze Gl: proteiny E2F jsou spojeny s Rb • E2F nemůže fungovat jako transkripční faktor, cílové geny E2F se neexprimují, S fáze nenastává pozdní fáze Gl: hyperfosforylace Rb, E2F se uvolňuje • E2F zajistí transkripci svých cílových genů, cyklus jde do S fáze • po přechodu do S fáze se proteiny E2F rychle inaktivují nebo degradují (fungují jen v úzkém časovém rozmezí na začátku fáze S) fppt.com Rb Regulation of the Cell E2F Unphosphorylated Rb binds transcription factor E2F. E2F cannot bind the DNA, and transcription is blocked. Cell growth triggers the phosphoryation of Rb. Phosphorylated Rb releases E2F, which binds the DNA and turns on gene expression, thus advancing the cell cycle. Cílové geny E2F cca 500 genů má ve svých promotorech vazebná místa pro E2F nezbytné pro vstup do S fáze: kódují např. proteiny, které katalyzují syntézu deoxyribonukleotidů (dihydrofolát syntáza, thymidin kináza) nebo jsou přímo zapojené do replikace DNA cílovými jsou rovněž geny kódující cyklin E a pro pozitivní zpětnou vazbu: - po přechodu bodu R rychle stoupá hladina cyklinu E a E2F - cyklin E je zodpovědný za hyperfosforylaci Rb, čímž se tvoří ještě více E2F a cyklinu E... - E2F je transkripční faktor, který posiluje svou vlastní expresi unphosphorylated cJrGi fa D CDK4 hypophosphorylated CDK2 cyclin E hyperphosphorylated r E2F Ti it cyclin E ě a a cm CDK2 Figure 8.25a The Biology of Can«r (© Garland Science 2014) Cílové geny E2F • gen kódující inhibitor pl6INK4 • negativní zpětná vazba • pl6 se váže ke komplexu CDK4-cyklin D a inhibuje jej • inhibice aktivační kinázy CAK • inhibice sestavování komplexů CDK4-cyklin D 49 Ukončení aktivity E2F • E2F je aktivátorem transkripce jen krátce • se zahájením fáze S dochází k aktivaci cyklinu A, který se spojí s CDK2 a fosforyluje E2F • následkem je ztráta transkripčně aktivační schopnosti E2F, ubikvitinace a proteazomový rozklad E2F je mocný induktor S fáze mikroinjekce proteinu E2F do vyhladovělých buněk ve fázi GO postačuje k indukci fáze S Fáze M zajištěna komplexy cyklinu B a CDC2, které fosforylují stovky proteinů: • proteiny asociované s chromatinem, které stimulují kondenzaci chromozomů (např. kondenzin) • proteiny jaderné membrány a pórů, které zajišťují stažení jaderné membrány do ER • proteiny asociované s mikrotubuly, které remodelují cytoskelet do mitotického aparátu • kinetochorové proteiny, které zajišťují sestavení kinetochorů a jejich připojení k mikrotubulům vřeténka • kinázy, které asistují při dalších procesech mitózy Fáze M Pro regulaci jsou zásadní dva procesy: • prudké zvýšení aktivity komplexu cyklinu B-CDC2 v kontrolním bodě G2/M, které vede k iniciaci procesů rané mitózy • působení ubikvitin ligázy APC/C: inaktivace komplexů cyklinu B-CDC2 a likvidace dalších klíčových M-fázových molekul (např. sekurinu), které vedou k dokončení mitózy Příprava chromozomů k segregaci • na konci S-fáze se každý replikovaný chromozom skládá z páru identických chromatid slepených k sobě • spojení sesterských chromatid zajišťuje kohezin • to usnadňuje pozdější mitózu - poruchy v mezíchromatidové kohezi vedou k vážným poruchám segregace chromozomů Kohezin • komplex proteinů, který je v průběhu replikace umístěn v mnoha místech po celé délce každé chromatidy Cohesin loaded in G1 can remain in place during DNA replication Kondenzace chromatid • replikovaná DNA po skončení fáze S má podobu dlouhých vláken, jejichž oddělení by znamenalo riziko poškození • buňka postupně reorganizuje chromatidy do kompaktnějších struktur, které mohou být snadněji odděleny • na konci metafáze mají chromatidy podobu tyčinkovitých struktur, které jsou pevně spojeny v oblasti centromery Kondenzace chromatid kondenzace i rozdělení chromatid se účastní kondenzin proteinový komplex složený z 5 podjednotek strukturní podoba s kohezinem kondenzin tvoří kruhové struktury, které využívají energie ATP pro skládání DNA do kompaktnější podoby fosforylace kondenzinu komplexem cyklin B-CDC2 stimuluje jeho schopnost navíjet DNA Metaphase chromatids Imaging Model Max. loop sizes -90 kb I Ratio Number 1Mb -74 nm I : II = 4 : 1 I -140,000 II -35,000 Max. loop sizes -450 kb O Condensin I complex O Condensin II complex Nucleosome Mitotické vřeténko • řada mikrotubulů zajišťujících rozdělení sesterských chromatid a segregaci sad chromozomů v anafázi • sestavení vřeténka stimuluje komplex cyklinu B a CDC2 Připojení chromatid k vřeténku: kinetochory • kinetochory: proteinové struktury v heterochromatinové oblasti centromery • konce mikrotubulů se napojují na kinetochory ve speciálních dotykových místech • spojení s kinetochory nebrání přidávání nebo odstraňování tubulinových jednotek, které vedou ke změně velikosti vřeténka Kinázy„Polo-like" a Aurora Podíl na zajištění rané mitózy Kináza Plk • sestavení mitotického vřeténka Kináza Aurora A • řídí sestavení a stabilitu vřeténka Kináza Aurora B • řídí připojení sesterských chromatid k vřeténku Anaphase-promoting complex (APC/C) ubikvitin ligáza řídící mitózu inhibitor anafáze (sekurin) inhibuje předčasnou degradaci proteinů, zajišťujících spojení sesterských chromatid (např. kohezinu) v rané mitóze ubikvitinace a rozklad sekurinu vede k aktivaci separázy, která štěpí kohezin a rozpojuje tak chromatidy ubikvitinace sekurinu je inhibována až do okamžiku připojení kinetochorů všech chromozomů k mikrotubulům vřeténka —— fppt.com DNA polymerase complex ¥* Sccl<_J Scc3v «W Smc1/Smc3 Replication fork S phase Mitotic Chromatin loops Cohesin complex chromosome y Sister chromatids^ / yCohesin\ Early mitosis Metaphase/ anaphase transition Sister chromatids separate Anaphase APC/C zajišťuje likvidaci sekurinu metafáze: sesterské chromatidy spojené kohezinem připraveny k segregaci sekurin dosud inhibuje separázu: kohezin se neštěpí všechny kinetochory připojeny k vřeténku: ubikvitin ligáza APC/C s adaptérovým proteinem Cdc20 zajistí polyubikvitinaci sekurinu (tím předurčen k degradaci) konec metafáze: rozklad sekurinu, aktivace separázy, štěpení kohezinu následkem je oddělení chromatid a začátek anafáze The actors... Durin prophase until metaphase. End of metaphase... Anaphase i i s s « APC/C zajišťuje i likvidaci cyklinu B • jakmile jsou kinetochory připojeny k vláknům vřeténka, zruší se inhibice faktoru Cdc20, který funguje jako aktivátor APC/C • APC/C se aktivuje připojením Cdc20 během anafáze • Cdc20 se podílí na rozeznání substrátů APC/C • APC/C katalyzuje připojení ubikvitinu na cílový protein, např. cyklin B • cyklin B se rozkládá • absence cyklinu B inaktivuje CDC2 • absence kinázové aktivity CDC2 umožňuje konstitutivně aktivním fosfatázám odstranit fosfáty z proteinů fosforylovaných CDC2: zakončení mitózy control of proteolysis by APC IC activating subunit (Cdc20) inactive APC /C Á M-eydin -J* Cdk active APC IC -1 ' ubiquitin (?) C!2/ + E2 ubiquitylation enzymes polyubiquitin chain DEGRADATION ^ OFM-CYCUNIN PROTEASOME fppt.com 62 Historie výzkumu buněčného cyklu Johnson a Rao, 1970 • spojení buněk v různých fázích cyklu fúzí: Gl + S • sledován průběh replikace DNA inkorporací značeného tymidinu • značka se objevila v DNA buňky fáze Gl i S: buňka ve fázi Gl po fúzi okamžitě zahájila replikaci Heterokaryon buňka Gl buňka S jádro Gl se replikuje Závěr: v S-fázové buňce existuje faktor, který indukuje replikaci v buňce Gl Historie výzkumu buněčného cyklu _ spojení buněk v různých fázích cyklu: Gl, G2, S + M buňka Gl, G2 nebo S buňka M retrakce jaderné membrány, chromozomy kondenzují Historie výzkumu buněčného cyklu milolKľ Gvphas» cell coll mnouc S ph»se coll ceil induced condensation of chromosomes front Gi phase cell induced condensation of chromosomes from S phase cell induced condensation of chromosomes from Gj-phase cell mctaphasc human chromosomes mctaphasc human chromosomes mctaphasc human chromosomes Historie výzkumu buněčného cyklu Nobelova cena za fyziologii a medicínu 2001 Výzkum cyklu u kvasinek Vvhodv kvasinkového modelu • znalost sekvence genomu • haploidní status • snadná kultivace, vysoká rychlost cyklu • snadné vizuální vyhodnocení fáze buněčného cyklu mikroskopií: - u pučících kvasinek {Saccharomyces cerevisiaě) nepřítomnost pupene: fáze Gl; přítomnost pupene menšího než u rodičovské buňky: fáze S, přítomnost pupene podobné velikosti jako u rodičovské buňky: fáze G2 - u štěpících se kvasinek (Schizosaccharomycespombé) lze na fázi cyklu usuzovat z délky buněk Výsledky bunečný cyklus je sled navazujících fazi nová fáze cyklu může nastat až po dokončení fáze předchozí - dominový efekt mutace v genech nutných pro průchod danou fází cyklu (cdč) se projeví synchronizací celé populace kvasinkových buněk-jejich cyklus se zastaví ve stejné fázi geny a/cjsou esenciální, proto kvasinky defektní v cdc nejsou životaschopné -připraveny podmínečně letální mutanti fppt.com A. Model of the cell cycle as a simple dependent pathway ■ ■11 1 111 C. CDC mutant II U D Arrest Exec point po G--^-s-N irtion nt ř ľ 1 _--5-J j-►rts Us - 20= if 1 :._-í-( 1-3^.^ —J Identifikace regulátorů cyklu alely wt mohou být izolovány z recesivních ts mutantů cdc transformací haploidních mutantních buněk plazmidovou knihovnou obsahující kvasinkové geny divokého typu lidská cDNA komplementuje deficit funkce kvasinkového genu cdc cdc28,s cells grown at 25 "C ® © Transform with plasmid library of wild-type S. cerevisiae DNA Gene X O Gene V O CDC28 O Transformed cdc28l* cells grown at 35 *C No colony formation ,(cj? Isolate COCA plasmid ä —>0 Ceils in colony at various cell-cycle stages Studium cyklu průtoková cytometrie sledování inkorporace značených deoxyribonukleotidů mikroskopie (M-fáze) i 4 cells in Gi phase í i 1 | í 1 í cells in G2and M phases 1 T cells in 1 1 Sphase A 1 J LJl 0 1 2 relative amount of DNA per cell (arbitrary units) fppt.com 70 Mitogeny všechny signály související s regulací proliferace musí být napojeny na buněčný cyklus mitogen I^M— mitogen receptor activation of gene regulatory protein CYTOSOL NUCLEUS immediate early gene expression gene regulatory protein delayed-response gene expression active J active Rb protein Glf:dk positive feedback Cti inactivated E2F protein active G^-Cdk """>! G|/S-eyelin ^S-phase gene_^ (cvdin E) _ 'V" \^ transcription S-cyclin (cyclin A) P positive feedback active S-Cdk dna 'synthesis inactivated Rb protein fppt.com Nádorový supresor p53 p53 je nestabilní, v nepoškozených buňkách je v nízké koncentraci důsledek jeho interakce s ubikvitin ligázou Mdm2 (jejíž expresi zajišťuje) fosforylace p53 v poškozených buňkách omezuje jeho interakci s Mdm2, tím se stabilizuje stabilizovaný p53 aktivuje expresi p21 a zastavuje tak buněčný cyklus DNA / x-rays DNA damage ATM/ATR kinase activation I Chk1/Chk2 kinase activation Mdm2 \ PHOSPHORYLATION OF p53 _1_ 1 p53 U Bl QUIT Y L AT I ON AND DEGRADATION IN PROTEASOMES stable, r*{? active pS3 ACTIVE p53 BINDS TO REGULATORY REGION OF p21 GENE f-F p21 gene TRANSCRIPTION J TRANSLATION J i p27 mRNA p21 (Cdk inhibitor protein) ACTIVE G v 5-Cdk and S Cdk INACTIVE G^S-CdkandS-Cdk complexed with p21 Mutace p53 výrazně zvyšuje genomovou nestabilitu TRANSGENICS ANONYMOUS