Buněčné signalizace Přednáška kurzu Molekulární biologie eukaryot 24.10. 2019 Jan Šmarda Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU 2 Osnova • molekulární principy buněčné signalizace • typy signálních molekul • typy receptorů • důsledky aktivace receptorů – přenos signálu vnitřním prostředím buňky • signální dráhy zprostředkované proteiny G • signální dráhy aktivované růstovými faktory • signální dráhy řízené cytokiny 3 Proč komunikovat? • podmínka řádné výstavby tkání a orgánů • reakce na podněty změnou metabolismu, růstu, diferenciace, pohybu, životaschopnosti, sekrecí proteinů apod. 4 Signální sítě 5 Princip signalizace • tvorba a přenos signálu • registrace signálu receptorem • přenos signálu z receptoru k efektorům („signal transduction“) • efektorem může být transkripční faktor, enzym, složka cytoskeletu, atd... • schopnost buňky reagovat na podněty je geneticky určena spektrem receptorů, které je schopna vytvořit 6 Chemická povaha signálů • proteiny • krátké peptidy • aminokyseliny • nukleotidy • steroidy • retinoidy • mastné kyseliny a jejich deriváty • plyny 7 Význam rozpustnosti signální molekuly 8 Hydrofilní signály • neprocházejí plazmatickou membránou • vážou se na povrchové receptory • z krve se odstraňují během několika minut • zprostředkovávají krátkodobé odpovědi 9 Lipofilní signály • v krvi se pohybují prostřednictvím nosičů • volně procházejí plazmatickou membránou • vážou se na cytoplazmatické nebo jaderné receptory • v krvi setrvávají hodiny až dni • zprostředkovávají dlouhodobé odpovědi (výjimka prostaglandiny) 10 Malý počet steroidních / tyroidních hormonů reguluje mnoho vývojových a fyziologických procesů u evolučně vzdálených organismů. Mechanismus účinku: malá velikost/lipofilní povaha hormonů - difúze membránou - pevná vazba na nitrobuněčné receptory - konformační změna receptorů zvýšená afinita ke specifickým sekvencím DNA - regulace transkripce cílových genů Nitrobuněčné receptory 11 Signální molekuly pro nitrobuněčné receptory • nízká molekulová hmotnost • hydrofobní povaha • jejich receptory jsou zároveň efektory 12 Receptor pro tyroidní hormon • váže se na DNA i za nepřítomnosti ligandu (represe transkripce) • přítomnost ligandu jej mění na aktivátor 13 Struktura nitrobuněčných receptorů • C-konec: vazba hormonu • N-konec: řízení transkripce • Střed molekuly: vazba DNA 14 Aktivace jaderného receptoru • vazba ligandu • „sevření“ ligandu receptorem (komplementarita povrchů) • disociace inhibičního proteinu • umožnění vazby koaktivátorových proteinů • vazba na DNA a aktivace transkripce cílových genů 15 Signalizace povrchovými receptory – signální kaskády mimobuněčný signál (ligand, „primary messenger“): • růstový faktor, cytokin, hormon, atd. povrchový receptor: • převod mimobuněčného ligandu do podoby nitrobuněčného signálu sekundární přenašeč: • nízkomolekulární struktura (cAMP, Ca2+, diacylglycerol, zbytek kyseliny fosforečné, atd.) • zesílení a přenos signálu od povrchových receptorů k efektorům cílová molekula (efektor): • enzym • složka replikačního aparátu • složka aparátu pro genovou expresi • složka cytoskeletu 16 • z jedné molekuly na druhou („relay“) • využití „lešení“(„scaffold“) pro udržení přenašečů ve vzájemné blízkosti • možnost převodu jednoho typu signálu na jiný („transduction“) • zesílení signálu tvorbou velkého počtu nitrobuněčných mediátorů: malý počet mimobuněčných signálů vyvolává významnou odpověď („amplification“) Principy přenosu signálů 17 • jedna molekula může přijímat signál z různých drah a integrovat jej, před jeho odesláním dále • signál se může větvit a šířit z jedné dráhy do jiné („spread“) • signál se může ukotvit do určité molekuly a imobilizovat se tak („anchor“) • signál může být ovlivněn jinými proteiny (např. inhibitory), které ovlivní jeho působení na efektory („modulate“) Principy přenosu signálů 18 Hlavní typy povrchových receptorů 1. Receptory typu iontových kanálků • vazbou ligandu ovlivňují průchodnost kanálků • mění se permeabilita membrány 19 Hlavní typy povrchových receptorů 2. Receptory napojené na protein G • nemají enzymovou aktivitu • řídí aktivitu efektorů prostřednictvím proteinu G („GTP-binding regulatory protein“) 20 Hlavní typy povrchových receptorů 3. Receptory s katalytickou aktivitou • katalytickou schopnost získávají vazbou ligandu • obvykle transmembránové proteiny s kinázovou aktivitou 21 Přenos signálu přes plazmatickou membránu Konformační změna receptoru • vyvolanou vazbou ligandu, která se projeví na vnitřní straně membrány • typické pro receptory se sedminásobným vinutím membránou Dimerizace receptoru • ligand seskupí inaktivní podjednotky receptorů, které jsou schopny laterálního pohybu membránou • dimerizace receptoru umožní takové přiblížení jejich kinázových cytoplazmatických domén, že se mohou vzájemně fosforylovat a tak aktivovat 22 Receptory se sedminásobným vinutím membránou • nejpočetnější rodina receptorů • 7 transmembránových α-šroubovic • evoluční konzervativnost • odpovídají na různé signály (světlo, aminokyseliny, peptidy, proteinové hormony, katecholaminy, lipidy) • interagují s proteinem G 23 • receptor se aktivuje ligandem • tuto informaci převede na protein G • GDP disociuje z proteinu G a je nahrazen GTP • protein G po navázání GTP ovlivní aktivitu důležitých enzymů Receptory se sedminásobným vinutím membránou 24 Dva hlavní typy proteinů G • trimerní (velké), které se indukují přímou vazbou s receptory • monomerní (malé) typu Ras, které interagují s receptory nepřímo prostřednictvím adaptérů • všechny proteiny G mohou vázat GTP/GDP a disponují GTPázovou aktivitou 25 Proteiny G a GTP • proteiny G kolísají mezi konformacemi „zapnuto“ (s GTP) a „vypnuto“ (s GDP) • zapínání zajišťují proteiny GEF (guanine nucleotide–exchange factors), které katalyzují disociaci GDP a jeho nahrazení nahrazení GTP • rychlost hydrolýzy GTP závisí na aktivitě GAPs (GTPase-accelerating / activating proteins), které mohou také reagovat na mimobuněčné signály 26 Objevitelé proteinů G Alfred G. Gilman a Martin Rodbell Nobelova cenu za fyziologii a medicínu v r. 1994 Alfred G. Gilman (1941-2015) Martin Rodbell (1925-1998) 27 Struktura velkých proteinů G • několik variant, každá typická pro určitý soubor receptorů a určitý soubor cílových proteinů 3 podjednotky: • α – obsahuje vazebné místo pro GTP/GDP, zajišťuje hydrolýzu GTP • ß a γ - ukotvují G protein na cytoplazmatické straně plazmatické membrány • u savců dosud charakterizováno 20 různých typů podjednotky α, 5 typů podjednotky ß a 6 typů γ • evoluční konzervativnost 28 Funkce proteinů G • spojovací články mezi povrchovými receptory a producenty sekundárních přenašečů • interagují pouze s aktivovanými receptory • výměna GDP na podjednotce α za GTP • podjednotka α s navázaným GTP přechází do aktivního stavu a odděluje se od podjednotek β a γ • uvolněná podjednotka α s navázaným GTP (podobně jako uvolněné podjednotky β a γ) interaguje se svou efektorovou molekulou v plazmatické membráně • rozmanitost efektorů: adenylátcykláza, fosfolipáza C, iontové kanálky) 29 Hlavní efektory proteinů G Proteiny G regulují propustnost iontových kanálků Např. regulace činnosti srdečního svalu acetylcholinem • nervová vlákna pro zpomalení činnosti srdce uvolňují acetylcholin • vazba acetylcholinu na povrchový receptor buněk srdečního svalu • aktivace proteinu G, disociace podjednotek • vazba komplexu βγ na kanálek K+ v plazmatické membráně • zvýšení propustnosti kanálku • změna elektrických vlastností buňky • zpomalení stahů • hydrolýza GTP: spojení podjednotek proteinu G • uzavření kanálku 31 Proteiny G aktivují enzymy • adenylátcyklázu (tvorba cAMP) • fosfolipázu C (tvorba inositoltrifosfátu a diacylglycerolu) • vzniklé rozpustné malé molekuly rychle difundují buňkou („druhotní poslové“) 32 Vypnutí signálu • nastává po několika sekundách aktivity proteinu G, kdy GTPázová aktivita podjednotky α vyvolá hydrolýzu GTP • rychlost hydrolýzy GTP ovlivňuje i aktivita GAPs • aktivita proteinu G je vymezena dobou, po kterou jsou podjednotky α a βγ disociovány • po hydrolýze GTP na GDP se podjednotky α, β, γ spojují a vypínají signál 33 Poruchy funkce proteinu G • tvorba nádorů • infekční choroby cholera: • Vibrio cholerae produkuje cholerový toxin (tj. enzym, který katalyzuje přenos ADP-ribózy na podjednotku α proteinu Gs a tím neadekvátně prodlužuje jeho aktivitu) • ADP ribozylace podjednotky α Gs vyvolaná cholerovým toxinem snižuje rychlost hydrolýzy GTP - protein Gs zůstává v aktivním stavu - neustálá aktivace adenylát cyklázy: vysoká hladina cAMP – vysoká propustnost sodíkových kanálků střevními buňkami - velká míra příjmu vody a iontů sodíku do střev – letální průjmy 34 Regulace tvorby cyklického adenozinmonofosfátu (cAMP) (cAMP objeven při studiu metabolismu glykogenu, Sutherland, 1958) Protein G: aktivace adenylátcyklázy 35 cAMP • hladina cAMP závisí na rovnováze aktivit adenylátcyklázy a cAMP-fosfodiesterázy • aktivita adenylátcyklázy je regulována proteinem G, aktivita cAMP-fosfodiesterázy podléhá regulaci jen vzácně (je konstitutivní) • rychlá změna koncentrace v reakci na mimobuněčné signály • rozpustnost cAMP ve vodě umožňuje jeho přesun z membrány do cytozolu 36 Regulace adenylátcyklázy Různé proteiny G (spojené s různými receptory) mohu mít na adenylátcyklázu různý vliv 37 Efektory cAMP Protein kináza A • fosforyluje např. transkripční faktor CREB (zodpovídající za transkripci genů vybavených sekvencí CRE – „cAMP-response element“) 38 Struktura protein kinázy A Inaktivní stav: • dvě regulační podjednotky (vazba cAMP) • dvě katalytické podjednotky Aktivní stav: vazba cAMP – změna konformace regulačních podjednotek – disociace regulačních podjednotek z komplexu – uvolněné katalytické podjednotky mohou fosforylovat své substráty PKA: • výskyt ve všech živočišných buňkách • zprostředkovává většinu účinků cAMP 39 Efektory cAMP Kináza fosforylázy a glykogen syntáza • oba enzymy zapojeny do metabolismu glykogenu • kináza fosforylázy - regulace fosforylázy štěpící glykogen • glykogensyntáza regulace syntézy glykogenu 40 cAMP a metabolismus glykogenu 41 Ionty Ca2+ • protein G ovlivňuje hladinu Ca2+ v cytozolu • různá koncentrace Ca2+ v cytozolu a mimobuněčném prostoru/buněčných zásobárnách: cytozol - 10-7M mimobuněčný prostor/zásobárny - 10-3M • důsledek činnosti iontových pump • koncentrační gradient tlačí ionty Ca2+ do cytozolu • zvýšená permeabilita membrány – vyšší koncentrace Ca2+ v cytozolu – aktivace nitrobuněčného signálního mechanismu 42 Dva způsoby vstupu Ca2+ do cytozolu 1. Depolarizací membrány (akčním potenciálem) – otevření vápníkových kanálků - zvýšený příjem Ca2+ z vnějšího okolí 43 Dva způsoby vstupu Ca2+ do cytozolu Signální kaskáda: • vazba ligandu k receptoru – aktivace • proteinu G – aktivace fosfolipázy Cβ – • tvorba IP3 a diacylglycerolu (DAG) z fosfatidylinositol-bisfosfátu • IP3 opouští plazmatickou membránu a difunduje cytozolem – otevře kanálky Ca2+ v ER – uvolnění Ca2+ do cytozolu 2. otevřením kanálků pro Ca2+ inozitoltrifosfátem (IP3) 44 Proteiny G a fosfolipáza C aktivace fosfolipázy C (2 způsoby): • zprostředkovaná proteinem G - aktivace fosfolipázy Cβ • přímou interakcí s receptorem pomocí domény SH2 - fosfolipáza Cγ 45 IP3 a DAG • produkty enzymové aktivity fosfolipázy C • IP3 zajistí uvolnění Ca2+ z buněčných zásob • diacylglycerol se účastní: a) metabolismu kyseliny arachidonové – syntéza prostaglandinů b) aktivace protein kinázy C 46 Efektory iontů Ca2+ Troponin C – přítomen v buňkách kosterního svalstva - úloha při svalové kontrakci Kalmodulin – jediný polypeptid se 4 místy pro vazbu Ca2+ - zprostředkovává většinu reakcí na Ca2+ 47 Kalmodulin po aktivaci Ca2+ • změna konformace • zvýšení afinity pro jiné proteiny • změna jejich aktivity • kalmodulin bývá stálou regulační složkou enzymových komplexů • důležitou cílovou molekulou řízenou komplexy kalmodulin/Ca2+ je Ca2+-dependentní protein kináza (Ca-kináza), která fosforyluje Ser/Thr cílových proteinů 48 Signální dráhy cAMP a Ca2+ vzájemně interagují • hladiny cAMP a Ca2+ se ovlivňují navzájem: - např. komplexy Ca2+/kalmodulin mohou vázat a regulovat aktivitu adenylát cyklázy - kináza A může fosforylovat některé kanálky určující obsah Ca2+ v cytozolu • Ca-kináza může být fosforylována kinázou A • kináza A a kináza Ca často fosforylují aminokyseliny téhož proteinu (např. CREB) 49 Katalytické receptory • zprostředkovávají reakce na růstové faktory/hormony • disponují proteinkinázovou aktivitou závislou na ligandu • glykozylovaná N-koncová doména směřuje ven z buňky • středová hydrofobní doména prochází membránou • C-koncová doména má kinázovou aktivitu nebo je schopna asociovat s nitrobuněčnými PTK – určuje typ signální dráhy a tím také charakter buněčné odpovědi 50 Receptorové tyrozinkinázy • cytoplazmatická doména má tyrozinkinázovou aktivitu závislou na vazbě ligandu • většinou polypeptidový řetězec, který prochází membránou jediným α-helixem (možnost laterálního pohybu membránou) • vazba ligandu vyvolá dimerizaci receptoru, následkem je transfosforylace partnerské podjednotky K fosforylovaným AK zbytkům se doménami SH2 váže řada různých proteinů 51 Přenos signálu receptorovými PTK 52 Doména SH2 • „Src homology“ • velikost cca 100 aminokyselin • nitrobuněčný „receptor“, který je součástí struktury některých proteinů • rozeznává a váže proteinové domény, které obsahují specifické fosfotyrozinové zbytky a krátký specifický oligopeptid dlouhý 3 – 6 zbytků AK, který s fosfotyrozinem sousedí Význam: • zajišťuje protein-proteinovou interakci • následkem je aktivace další části signální dráhy 53 Doména SH2 v signálních drahách 54 • transfosforylace receptoru vede k vytvoření specifické řady fosforylovaných tyrozinů v cytozolické doméně • fosfotyroziny vyhledány různými cytoplazmatickými proteiny s doménami SH2: enzymy metabolismu fosfolipidů (fosfolipáza C), proteiny G (Grb2, Shc, Ras), transkripčními faktory (STAT) • po spojení s receptorem mohou být tyto substráty receptorovou kinázou fosforylovány Doména SH2 v signálních drahách 55 Důsledky interakce domény SH2 s fosfotyrozinem závisí na povaze cílového proteinu • změna konformace proteinu • usnadnění interakce s jinými proteiny • změna aktivity proteinu • translokace proteinu do jiné části buňky 56 Příklad zapojení domény SH2 do signalizací: dráha Ras součást mitogenní signální kaskády – ligand/receptor-Grb2-Sos-Ras • adaptérový protein Grb2 obsahuje domény SH2 a SH3 • doménou SH2 se spojuje s aktivovanou receptorovou PTK • doménou SH3 se spojuje s proteinem Sos • Sos je GEF protein - zajišťuje výměnu GDP za GTP na proteinu G Ras 57 Ras: součást signální dráhy MAP • aktivovaný Ras váže a aktivuje efektory - Raf, fosfoinositid kinázu 3, Ral • Raf je serin-treonin kináza, která spouští kaskádu kináz MAP (Raf-MEK-ERK) 58 • aktivovaná kináza ERK přechází do jádra, kde fosforyluje např. transkripční faktor Elk-1 • Elk-1 indukuje transkripci genů potřebných pro proliferaci buňky Ras: součást signální dráhy MAP 59 Ras-GTP Ras-GDP Aktivace a inaktivace Ras GTP GDP H2O Pi Exchange HydrolysisGuanine Nucleotide Exchange Factors (GEFs) GTPase Activating Proteins (GAPs) 60 Ras-GTP Ras-GDP Mutantní Ras v nádorových buňkách nemůže hydrolyzovat GTP a hromadí se v aktivním stavu GTP GDP Exchange X Ras a nádory 61 Kinázová kaskáda MAP • MAPK („mitogen-activated protein kinases“) • rodina serin/treonin proteinových kináz • vysoká konzervativnost v eukaryontních buňkách • účast na procesech proliferace, diferenciace, pohybu a buněčné smrti • MAPK (ERK) jsou fosforylovány a aktivovány kinázami MAPK (MAPKK, MEK) • MAPKK jsou fosforylovány a aktivovány kinázami kináz MAPK (MAPKKK, Raf) • MAPKKK jsou aktivovány interakcí s malými G-proteiny (např. Ras) nebo jinými kinázami, které jsou napojeny na povrchové receptory 62 Efektory Ras: kináza Raf (MAPKKK) • Ras přitahuje cytozolickou kinázu Raf (MAPKKK) a aktivuje ji • kináza Raf fosforyluje kinázu MEK (MAPKK) • kináza MEK fosforyluje 2 další kinázy Erk1 nebo Erk2 (MAPK) • kinázy Erk fosforylují své substráty: transkripční faktory (Ets, Elk-1, SAP-1) nebo další kinázy (Mnk1). • Ets řídí expresi genů kódujících cyklin D1, Fos, atd.) 63 Efektory Ras: Fosfatidylinositol 3 kináza • Ras aktivuje fosfatidylinositol 3 kinázu (PI3K): vzniká fosfatidylinositol 3 fosfát (PIP3), který přitahuje proteiny s doménou PH („pleckstrin homology“): např. kinázu Akt (tj. protein kinázu B), která se tímto aktivuje a ovlivní aktivitu svých substrátů, které řídí životaschopnost, růst a proliferaci buněk • další substráty s PH doménou: rodina malých proteinů typu Rho vážoucích GTP (ovlivňují dynamiku cytoskeletu) 64 Efektory Ras: proteiny Ral • Ral-A a Ral-B mají vysokou homologii s Ras • aktivace Ral je založena na výměně GDP za GTP • asociace s Ras způsobuje konformační změnu Ral-GEF vedoucí k aktivaci GEF a následnému přenosu GTP na Ral • aktivované proteiny Ral-A a Ral-B ovlivňují své substráty, např. inhibují Cdc42 a Rac (tj. členy rodiny Rho ovlivňující buněčnou polaritu, adhezi, migraci, proliferaci, aktinový cytoskelet a vezikulární transport) 65 Efektory Ras: Rac a Cdc42 • Cdc42 kontroluje organizaci aktinových vláken a filopodií (malých extensí cytoplazmy, kterými si buňka „osahává“ své okolí) • Rac kontroluje tvorbu lamelipodií (rozsáhlých výběžků cytoplazmy, které se tvoří v souvislosti s pohybem buněk) https://www.youtube.com/watch?v=vAaQ4WS8QhI https://www.youtube.com/watch?v=t3u2_pAEB94 66 Objev onkogenu ras: rok 1982 Michael Wigler Mariano Barbacid Robert Weinberg 67 Receptorové serinové/treoninové kinázy • složené ze dvou odlišných podjednotek, každá z nich má cytoplazmatickou doménu se serin/treonin-kinázovou aktivitou • aktivaci zajišťuje dvojice spojených ligandů (ligandový dimer) • obě podjednotky receptoru se podílejí na aktivaci transkripčních faktorů Smad • proteiny Smad regulují expresi genů, jejichž produkty řídí buněčnou proliferaci a diferenciaci Příklady ligandů: transformující růstový faktor ß aktivin kostní morfogenní proteiny 68 Ligandy pro receptorové serinové/treoninové kinázy TGF-ß • inhibuje proliferaci buněk • stimuluje tvorbu extracelulární matrix – kolagenu, proteoglykanů, a adhezivních glykoproteinů – podmínka správného vývoje orgánů Ztráta receptoru pro TGF-ß: vznik některých nádorů, ztráta schopnosti reagovat na TGF-ß zastavením růstu buněk Aktivin ovlivňuje diferenciaci raných embryonálních buněk při formování zárodečných vrstev Kostní morfogenní proteiny ovlivňují diferenciaci osteoblastů (a dalších buněk) 69 Signalizace TGFß • seskupení receptorů TGFß RI-RIII • aktivovaný RI fosforyluje transkripční faktor • Smad3 nebo jiný R-Smad („receptorregulated Smad“): změna konformace, která obnaží jaderný lokalizační signál NLS • 2 fosforylované molekuly Smad3 interagují s proteinem Smad4 a importinem ß • vzniklý cytozolový komplex přechází do jádra, kde se importin uvolňuje • Smad3/Smad4 se spojí s transkripčním faktorem TFE3: aktivační komplex, který se váže na regulační sekvence cílových genů 70 Receptory pro cytokiny cytoplazmatická doména nemá enzymovou aktivitu, ale nekovalentně váže tyrozinové kinázy Jak/Tyk • vazba ligandu receptor aktivuje tak, že buď spojí původně oddělené jednotky nebo změní konformaci preformovaných dimerů • následkem je vzájemná transfosforylace asociovaných kináz JAK, TYK2 71 • využívaná cytokiny • účast na řízení růstu, přežití, diferenciace a odolnosti k patogenům • Jak „Janus-family tyrosin kinase“ • STAT „Signal transducer and activator of transcription": • transkripční faktory opatřené doménou SH2 • v nestimulovaných buňkách inaktivní, lokalizovány v cytoplazmě Signalizace: • Jak fosforyluje STAT a stimuluje tak jeho translokaci do jádra, kde aktivuje transkripci genů • systém zajišťuje přímé spojení mezi povrchem buňky a jádrem Signální dráha Jak/STAT 72 Signální dráha Jak/STAT Jak se konstitutivně asociuje s receptorem • stimulace receptoru cytokinem • dimerizace receptoru • aktivace kináz Jak, Tyk2 • fosforylace receptoru • fosforylovaný receptor interaguje s doménou SH2 proteinu STAT • Jak/Tyk2 fosforyluje STAT • fosforylovaný STAT se odděluje od receptoru, dimerizuje a přechází do jádra • v jádře STAT zajistí aktivaci transkripce cílových genů Jak fosforylují i jiné signální proteiny – propojení různých signálních drah 73 Signální dráha Jak/STAT proteiny SOCS ("suppressors of cytokine signaling") a fosfatáza SHP1 tlumí signální dráhu JAK/STAT zpětnou vazbou 74 Negativní regulace signalizace dráhy Jak/STAT Proteiny SOCS • negativní regulátory signalizace cytokiny • kódovány geny, jejichž transkripce je indukována proteiny STAT 2 mechanismy: • doménou SH2 se proteiny SOCS vážou na fosfotyroziny aktivovaných receptorů: znemožnění vazby dalších proteinů • doménou SOCS box je zajištěna interakce SOCS s ubikvitin ligázou: polyubikvitinace a likvidace JAK proteazomem 75 Fosfatázou SHP1 • SHP1 je inaktivní v nestimulovaných buňkách (doména SH2 se váže na katalytické místo a inaktivuje jej) • ve stimulovaných buňkách SH2 doména váže fosfotyrozin aktivovaného receptoru • konformační změna SHP1 obnaží katalytické místo fosfatázy SHP1 a dopraví jej do blízkosti kritického fosfátu kinázy Jak • odstraněním fosfátu se Jak inaktivuje Negativní regulace signalizace dráhy Jak/STAT 76 Receptory pro cytokiny Příklady ligandů: Růstový hormon řídí růst a vývoj těla (mutace receptoru způsobují růstovou nedostatečnost) Erytropoietin reguluje proliferaci a diferenciaci prekurzorů červených krvinek (mutace receptoru způsobují poruchy tvorby erytrocytů) Interleukiny řídí buňky imunitního systému (mutace receptoru způsobují imunodeficienci) 77 Signalizace Notch • zapojené do signalizací spojených s raným embryonálním vývojem • jako ligandy slouží proteiny Delta (u much) obecně NotchL • po aktivaci ligandem receptory Notch aktivují signální dráhu ovlivňující vývoj organismu Struktura: • několik extracelulárních domén typu EGF, jedna transmembránová doména, nitrobuněčná doména bez enzymové aktivity • po aktivaci dochází ke 2 proteolytickým reakcím (1x v ektodoméně, 1x v transmembránové doméně), produkt štěpení ztrácí ukotvení k membráně, uvolňuje se do cytozolu a později do jádra, kde ovlivňuje transkripci 78 Signalizace Hedgehog • Hedgehog je proteinový ligand objevený u drozofily • na přijetí signálu Hedgehog se podílejí membránové proteiny Patched (receptor) a Smoothened Funkce: • nezbytný pro segmentování embrya • homologní struktury jsou popsány u člověka: řídí diferenciaci mnoha tkání, např. nervového systému • mutace v jednom ze tří známých genů hedgehog způsobují závažné vývojové poruchy • mutace v genu patched způsobují karcinom kůže 79 Signalizace Hedgehog • za nepřítomnosti ligandu Hedgehog: Patched inhibuje Smoothened • za přítomnosti Hedgehog: naváže se na Patched, který uvolňuje Smoothened • uvolněný Smoothened stabilizuje protein Gli • Gli se transportuje do jádra, kde se podílí na tvorbě funkčních transkripčních faktorů 80 Signalizace Wnt • proteiny Wnt jsou signální molekuly ovlivňující embryonální vývoj • vážou se na povrchové receptory rodiny Frizzled a koreceptor LRP • aktivované receptory Frizzled přes protein Dishevelled signál předávají dále do buňky – rozhodují o hladině volného ß-kateninu 81 ß-katenin • v embryonálních buňkách obvykle vázán s kadheriny, účast na mezibuněčných spojích • pokud není spojen s kadheriny, podléhá rychlé degradaci v degradačním komplexu složeném z proteinů: casein kinase 1 (CK1), glycogen synthase kinase 3 (GSK3), axin a Adenomatous polyposis coli (APC), kde fosforylace ß-kateninu kinázou CK1 umožňuje jeho následnou fosforylaci kinázou GSK3, čímž je umožněna jeho ubikvitinace a degradace v proteazomu 82 ß-katenin a Wnt • když se naváže Wnt na Frizzled a LRP, vytvoří oba receptory komplex s axinem a APC, který je s pomocí aktivovaného Dishevelled fosforylován kinázami GSK3 a CK1 • komplex je tím inaktivován, ß-katenin se nefosforyluje a tím zůstává stabilní • ß-katenin se hromadí, přechází do jádra, kde ovlivní genovou expresi • mezi geny aktivované Wnt patří např. protoonkogen c-myc (stimuluje proliferaci buněk) • mutace v genu APC jsou velmi časté u střevních nádorů (inhibují schopnost proteinu APC vázat ß-katenin, který se pak hromadí a ovlivněním genové exprese přispívá k maligní transformaci buněk) 83 Receptory zajišťující fosforylaci IκB • transkripční faktory rodiny NFκB jsou regulovány na úrovni translokace do jádra • inhibitory IκB zadržují NFκB v cytoplazmě • řada receptorů po aktivaci ligandem dokáže aktivovat kinázu IKK, fosforylující IκB • fosforylovaný IκB je předurčen k proteolytické degradaci 84 Souhrn • buňky komunikují prostřednictvím signálních molekul • signály buňky zachycují signály specifickými receptory na povrchu nebo uvnitř buněk • rozmanitými nitrobuněčnými signálními drahami se signál o interakci ligandu s receptorem dostává k buněčným efektorům, který zajistí adekvátní reakci buňky • schopnost produkovat a/nebo detekovat signály a adekvátně na ně reagovat je podmínkou řádného vývoje embrya i udržování homeostáze dospělého organismu v proměnlivém prostředí