Remodelace chromatinu Přednáška kurzu Molekulární biologie eukaryot 7. a 14.11.2019 Jana Šmardová Jan Šmarda Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Nezbeda O: Je možné zdědit strach či hřích? Respekt 35 21.-31.8. 2014 Podtitul: Z nových biologických poznatků vyplývá, že máme svůj genetický osud pod kontrolou víc, než se dosud myslelo.  rozluštění genetického kódu v polovině 20. století = převrat v biologii: zdálo se, že jsme objevili „boží jazyk“, základní úroveň, z níž bude možné definitivně vysvětlit vznik života a jeho evoluci… Je možné zdědit strach či hřích? Brian G. Dias Kerry J. Ressler Dias BG a Ressler KJ: Nat Neurosci. 17(1) 2014, 89-96 Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in sebsequent generations • dávali myším samcům čichat acetofenon a propanon (voní po třešních a mandlích) a přitom jim pouštěli elektrické šoky do tlapek • po pár týdnech myšáci tuhli a nadskakovali strachy, kdykoliv vůni ucítili (= podmíněný reflex/Pavlov slintající psi)  potomci: samotná vůně acetofenonu a propanonu v nich vyvolávala strach! • spolehlivě bez vlastní zkušenosti! • i při oplodnění ve zkumavce, tj. nulový kontakt myšat s otci  zděděný strach si předávaly ještě tři další generace! teprve potom postupně vymizel Brian G. Dias Kerry J. Ressler Dias BG a Ressler KJ: Nat Neurosci. 17(1) 2014, 89-96  můžeme zdědit i strachy a úzkosti našich rodičů a předat je dál svým vlastním dětem...  za tímto typem dědičnosti stojí epigenetické mechanismy: konkrétně v tomto experimentu mikroRNA (gen Olfr151, miR-34a, signální dráha Notch)  DNA je sice hlavním paměťovým médiem dědičnosti, ovšem kdy a co se bude přehrávat a jakým způsobem, na tom se spolupodílíme  na čtení genetického kódu je příhodnější nazírat jako na nesmírně bohatou síť různých promluv, diskusí a smlouvání; namísto vojenských povelů je to chat buněčného Facebooku Dias BG a Ressler KJ: Nat Neurosci. 17(1) 2014, 89-96; Nezbeda O. Respekt 35 21.-31.8. 2014 Je možné zdědit strach či hřích? Epigenetika  studuje potenciálně stabilní a potenciálně dědičné změny v genové expresi nebo změny v buněčném fenotypu, které se objevují beze změn na úrovni Watson-Crickova párování bází DNA  ~ spojení mezi genotypem a fenotypem  ačkoliv většina buněk organismu má stejný genotyp, výrazně se liší svým fenotypem: buněčnou diferenciaci lze chápat jako epigenetický jev  metylace DNA  metylace RNA  kovalentní modifikace histonů  nastavení pozice nukleozomů: ATP-dependentní chromatin remodelující komplexy  varianty histonů  nekódující RNA včetně miRNA  jaderná lokalizace Epigenetické mechanismy Funkce remodelace chromatinu  regulace genové exprese, diferenciace  replikace DNA a sestavování nukleozomů  kondenzace chromozomů během mitózy  rozlišení heterochromatinu a euchromatinu  opravy DNA  inaktivace chromozomu X  … a další Osnova přednášky • struktura a funkce chromatinu • metylace DNA • kovalentní modifikace histonů  acetylace  fosforylace  metylace  ubikvitinace • ATP-dependentní chromatin remodelující komplexy • histonové varianty (a nekódující RNA) • součinnost jednotlivých typů přestavby chromatinu  inaktivace chromozomu X Struktura a funkce chromatinu Motto „… smyslem uspořádání do chromatinu není pouze sbalit 2 m DNA do 5 μm jádra, ale také vytvořit významnou platformu pro regulaci genové exprese…“ (Richly, Di Groce 2010) tenisový míček obsahující 20 km extrémně jemné nitě • chromozom: 1 dlouhá lineární molekula DNA a proteiny, které umožňují vytvoření kompaktní struktury • chromatin: komplex DNA a proteinů: vedle proteinů pomáhajících sbalení, také proteiny zajišťující funkce spojené s DNA • specializované sekvence na chromozomech: replikační počátky, centromery a na nich se tvořící komplexy kinetochory, telomery Struktura eukaryotických chromozomů  soubor všech chromozomů v buněčném jádře • autozomy 1 až 22 seřazeny podle velikosti, pohlavní chromozomy X a Y • šipky ukazují pozici centromery • výčnělky na chromozomech 13, 14, 15, 21 a 22 obsahují geny pro rRNA • barvení podle Giemsy, tmavě se barví oblasti s vysokým obsahem A-T 1 12 13 22 X Y Karyotyp Pruhování lidských chromozomů • nejčastěji rutinně užívaná metoda: G pruhování trypsin (natráví chromozomové proteiny) Giemsovo barvivo (směs barviv)  tmavé pruhy bohaté na A-T, světlé na G-C  specifické pro každý chromozomový pár  lze rozpoznat strukturní a numerické abnormality (1 pruh obsahuje 50 i více genů) Interfázní vs. kondenzované (mitotické) chromozomy při mitóze je chromatin kondenzován 10 000x Uspořádání DNA do chromatinu 1. Ochrana (a kondenzace) DNA 2. Snížená dostupnost pro DNA vazebné proteiny: - transkripce - replikace - opravy DNA - rekombinace  chromatin má velmi stabilní a odolnou strukturu  chromatin musí být reverzibilně flexibilní  základními jednotkami jsou nukleozomy, tvoří strukturu „korálky na niti“; 11 nm  nukleozomy těsně přiloženy k sobě, za účasti histonu H1 tvoří 30 nm vlákno  dále vznikají vysoce kondenzované struktury (300 nm a 700 nm)  mitotické chromozomy (1400 nm) Úrovně kondenzace chromatinu Úrovně kondenzace chromatinu Struktura nukleozomu  DNA: 146 pb (1 a ¾ otáčky superhelixu  oktamer histonů: tetramer (H3/H4)2 a dva dimery H2A/H2B  úseky DNA mezi nukleozomy (linker DNA) různě dlouhé (15 až 55 pb; v průměru asi 200 pb na 1 nukleozom), interagují s histonem H1 a podílejí se na vytváření vyšších struktur chromatinu (30 nm)  5-10 násobná kondenzace chromatinu Úloha histonu H1 při vytváření 30 nm vlákna  malé proteiny s vysokým obsahem bazických aminokyselinových zbytků (lysin, arginin; 20-30%)  pozitivní náboje umožňují pevné navázání histonů na negativně nabitou cukr-fosfátovou kostru DNA (bez ohledu na sekvenci nukleotidů)  nejvíce konzervované proteiny mezi eukaryoty Histony histon poměr Lys/Arg počet AA molekulová hmotnost H1 20,0 215 21 000 H2A 1,2 129 14500 H2B 2,5 125 13 800 H3 0,72 135 15 300 H4 0,79 102 11 300 Uspořádání histonů v nukleozomu  C-koncové části histonů tvoří jádro nukleozomu  N-části vybíhají do stran, tvoří tzv. N-tails a jsou volněji přístupné různým modifikacím Kovalentní modifikace histonů Kovalentní modifikace histonů acetylace metylace fosforylace ubikvitinace Kovalentní modifikace histonů  dopad modifikace záleží na typu modifikace, na typu a pozici modifikovaného aminokyselinového zbytku • acetylace, ubikvitinace zbytků lysinu (K) • metylace zbytků lysinu (K) a argininu (R) • fosforylace zbytků serinu (S) a threoninu (T) • ubikvitinace zbytků lysinu (K)  téměř dvacet různých typů modifikací na více než 150 konzervovaných zbytcích AA na histonových proteinech Kovalentní modifikace histonů lysin (K) (acetylace, metylace, ubikvitinace)  sumoylace (regulace transkripce, opravy DNA)  ADP-ribosylace (regulace transkripce, opravy DNA, replikace)  formylace (oxidativní stres, zánět)  propionylace (regulace transkripce, karcinogeneze, metabolismus, diferenciace)  butyrylace (regulace transkripce, spermatogeneze, metabolismus, diferenciace)  malonylace (regulace genové exprese, metabolismus)  krotonylace (regulace transkripce, spermatogeneze, stres, inaktivace X)  sukcinylace (regulace transkripce, metabolismus, opravy DNA, onkogeneze)  glutarylace (regulace genové exprese) Kovalentní modifikace histonů arginin (R) (metylace)  citrulinace (regulace genové exprese, imunita, embryogeneze) serin (S) (acetylace, fosforylace)  glykosylace (regulace genové exprese, onkogeneze) threonin (T) (acetylace, fosforylace)  glykosylace (stabilita nukleozomu) tyrosin (Y) (acetylace, fosforylace)  glykosylace (regulace genové exprese, onkogeneze) histidin (H) (fosforylace)  glykosylace (regulace genové exprese) Kovalentní modifikace histonů acetylace – metylace – fosforylace - ubikvitinace Acetylace histonů  zbytky lysinu: celkem 26 různých možností na 1 nukleozom  histon acetyl transferázy (HATs): Gcn5, CBP/p300, PCAF, SRC-1, ACTR, ESA1, MOZ, Tip60, TAF250,..  histon deacetylázy (HDACs): HDAC1, 2, 3… Acetylace histonů: sestavování nukleozomů  heterodimerizace H3/H4  vznik tetrameru (H3/H4)2  vazba na DNA  heterodimerizace H2A/H2B  připojení k tetrameru (H3/H4)2 1. replikující se DNA : (H3/H4)2 - CAF1 („chromatin assembly factor 1“): interakce (H3/H4)2 s CAF1 podmíněna acetylací histonu H4 na K5, K8 nebo K12 (ne K16) nebo jejich kombinací 2. vytvoření komplexu H2A/H2B - NAP1 („nucleosome assembly protein 1“) • cytoplazmatická HAT1 - acetyluje (K5, K12) volný H4 neuspořádaný do nukleozomů (a méně efektivně také K5 H2A Acetylace histonů: rozlišení heterochromatinu a euchromatinu  heterochromatin acetylován výlučně na K12 H4  vazba komplexů RAP1 („repressor/activator protein 1“) a SIR („silencing information regulator 2, 3, 4“) (RAP1 se váže na telomerickou DNA) ? sestavování nukleozomů: acetylace H4 K5 a K12 heterochromatin: acetylace K12 ? 1. pouze acetylace K12 H4 a znemožněna další acetylace heterochromatinu 2. acetylace K5 i K12 a duplikace heterochromatinu spojena s deacetylací K5 (pravděpodobně za účasti HP1 („heterochromatin protein 1“), CAF1 a příslušné HDAC Acetylace histonů: regulace transkripce • acetylace histonů je spojena se vznikem tzv. otevřené struktury chromatinu a s aktivací transkripce • deacetylce histonů spojena s uzavíráním struktury chromatinu a s represí transkripce  HATs a HDACs jsou přiváděny k cílovým sekvencím prostřednictvím sekvenčně specifických transkripčních faktorů  obvykle fungují jako součást multiproteinových komplexů histony histony acetylace působením HATs umožňuje transkripci a genovou expresi deacetylace působením HDACs reprimuje transkripci a genovou expresi HAT ACETYLACE HISTONů DEACETYLACE HISTONů HDAC acetylované histony otevřený chromatin transkripční faktory mají přístup k DNA deacetylované histony uzavřený chromatin transkripční faktory se nemohou dostat k DNA transkripční faktory –Ac Ac– Ac– Acetylace histonů: regulace transkripce Acetylace histonů a regulace transkripce: jaderné receptory • acetylace histonů je spojena se vznikem tzv. otevřené struktury chromatinu a s aktivací transkripce • deacetylce histonů spojena s uzavíráním struktury chromatinu a represí transkripce • HATs a HDACs jsou přiváděny k cílovým sekvencím prostřednictvím sekvenčně specifických transkripčních faktorů • jsou součástí multiproteinových komplexů aktivace represe Acetylace histonů a regulace transkripce: onkoprotein Myc Acetylace histonů a regulace transkripce: onkoprotein Myc Histon acetyl transferázy HAT typu A: - lokalizovány v jádře - podílejí se na regulaci genové exprese - obsahují bromodoménu - např. Gcn5, p300/CBP, TAFII250,… HAT typu B: - lokalizovány v cytoplazmě - acetylují nově syntetizované histony před tím než se stanou součástí nukleozomů - neobsahují bromodoménu - např. HAT1 bromodoména asi 110 AA velká; rozpoznává acetylované zbytky lysinu Gcn5 – histon acetyl transferáza kvasinek CBP/p300 - koaktivátory: CREB (CBP – „CREB binding protein), E1A, jaderné receptory, c-Myb/v-Myb, c-Fos, c-Jun/v-Jun, Stat-1, Stat-2, GATA-1, p53, NF-kB,.. - integrátory PCAF - „p300/CBP associated factor“ SRC-1, ACTR, ESA1, MOZ, Tip60, TIF2, TAF250 – např. regulátory jaderných receptorů Histon acetyl transferázy Histon acetyl transferázy jako integrátory  zvýšená nebo snížená exprese některých transkripčních faktorů ovlivňuje vývoj – diferenciaci konkrétního buněčného typu  úroveň a časování exprese transkripčních faktorů ovlivňuje osud buněk Histon acetyl transferázy jako integrátory Histon acetyl transferázy jako integrátory: paradigma PU.1:GATA1  Progenitorové buňky fluktuují mezi dvěma stavy určovanými poměrem aktivity transkripčního faktoru PU.1 a GATA1. Po (indukovaném nebo spontánním rozhodnutí - „commitment“) diferencují buď v myeloidní nebo erytroidní buňky a převažuje v nich aktivita TF PU.1 nebo GATA1.  monocytické/erytroidní progenitory erytroidní buňky (GATA1)myeloidní buňky (PU.1) Graf T and Enver T, Nature 2009 „cross-antagonismus“ dvou transkripčních faktorů: dva regulátory  negativně ovlivňují jeden druhého a zároveň  pozitivně ovlivňují sebe sama Histon acetyl transferázy jako integrátory: paradigma PU.1:GATA1 Graf T and Enver T, Nature 2009 Jaký mechanismus je podstatou cross-antagonismu PU.1 a GATA1? K aktivaci svých cílových genů v erytroidních buňkách potřebuje GATA1 protein CBP. Vysoká hladina PU.1 ale odebírá CBP z vazby na GATA1… myeloidní buňky (PU.1) erytroidní buňky (GATA1) Histon acetyl transferázy jako integrátory: paradigma PU.1:GATA1 Graf T and Enver T, Nature 2009 Cross-antagonismus transkripčních faktorů v kaskádovité krajině stabilních a nestabilních buněčných stavů údolí – stabilně diferencované buněčné typy vrcholky, svahy – nestabilní, přechodné, progenitorové buněčné typy Gcn5 – histon acetyl transferáza kvasinek CBP/p300 - koaktivátory: CREB (CBP – „CREB binding protein), E1A, jaderné receptory, c-Myb/v-Myb, c-Fos, c-Jun/v-Jun, Stat-1, Stat-2, GATA-1, p53, NF-kB,.. - integrátory PCAF - „p300/CBP associated factor“ SRC-1, ACTR, ESA1, MOZ, Tip60, TIF2, TAF250 – např. regulátory jaderných receptorů Histon acetyl transferázy • některé HATs acetylují i nehistonové proteiny - např. CBP/p300: p53, E2F1, GATA-1, TFIIF, Myb,… HMG – high mobility group proteins - váží se na nukleozomy a stabilizují jejich strukturu, účastní se transkripce, replikace, rekombinace, oprav DNA,…  CBP acetyluje HMG-1  PCAF acetyluje HMG-17 na K2  oslabení vazby HMG-17 na nukleozom: vazba HMG-17 na nukleozom snižuje schopnost PCAF acetylovat H3  p300 acetyluje HMG-14 a HMG-17  modifikace jejich interakce s jádrem nukleozomu Acetylace nehistonových proteinů Acetylace: histonů a nehistonových proteinů • proteiny často acetylovány na N-konci  N-terminální acetyl transferázy (NATs); (faktor acetyl transferázy - FATs)  multifunkční proteiny  N-terminální acetylace patří k hlavním buněčným regulátorům  s ribozomy asociované ko-translační i post-translační modifikace Acetylace nehistonových proteinů Aksnes H et al, Mol Cell 73: 1097-1114, 2019 Histon deacetylázy  „klasické“ HDACs; jejich funkci inhibuje TSA – trichostatin A • třída I: HDAC 1, 2, 3, 8 • třída II : HDAC 4, 5, 6, 7, 9 a 10 • třída I: příbuzné Sir2 kvasinek (silent information regulator 2)  sirtuiny = třída III: – jejich funkci neovlivňuje TSA • HDAC 1, 2, 8 – hlavně v jádře • HDAC 3 – v jádře i cytoplasmě a také asociována s membránami • HDAC 4, 5, 6, 7, 9 a 10 - mohou být opakovaně transportovány do jádra a z jádra na základě signalizace • HDAC 6 – cytoplazmatická, asociována s mikrotubuly  celkem 18 hHDACs  vrozené vývojové onemocnění spojené s mentální a růstovou retardací, typickými obličejovými malformacemi, širokými palci u nohou a rukou….  příčinou je zárodečná mutace jedné alely genu pro histon acetyl transferázu CBP a následná snížená dávka genu, tzv. haploinsuficience  gen je lokalizován na chromozomu 16 (16p13.3) Rubinstein-Taybiho syndrom Metylace DNA Metylace DNA a deacetylace histonů • 5-metylcytosin („pátá báze“) - může být enzymaticky tvořen a udržován na dinukleotidu CpG • (metylové zbytky objeveny také na dinukleotidech CpA, CpC nebo CpT; v oocytech, embryonálních buňkách, neuronech) • CpG ostrůvky („CpG islands“) - jsou oblasti v genomu s vysokým obsahem těchto sekvencí, často v promotorech, obvykle nemetylovány • CpG metylace DNA spojena s represí transkripce (a obecně s „represí chromatinu“: represe rekombinace,…)  Metylace 6mA v DNA • 6mA (N6-metyladenin) DNA je převládající modifikací u prokaryotických buněk • tato modifikace zastoupena bohatě také v lidském genomu, především v kódujících oblastech, pravděpodobně souvislost s regulací (aktivací) transkripce • za metylaci N6 adeninu v DNA odpovídá metyltransferáza N6AMT1, a demetyláza ALKBH1 Xiao C-L et al, Mol Cell 71: 306-318, 2018 Rodina lidských DNMT • DNMT1 – udržovací („maintenance“) – 10x vyšší afinita k semimetylované DNA, mnohem aktivnější než DNMT3a a 3b • DNMT3a a DNMT3b – de novo – metylují nemetylovanou DNA • DNMT2 – katalyzuje hlavně metylaci tRNA Jeltsch A et Jurkowska RZ, Nucl Acid Res 44 (18): 8556-8575, 2016  Metylace RNA • 6mA modifikace mRNA • rychle se rozvíjející komplikovaná, heterogenní oblast biologie • (modifikace/metylace i dalších typů RNA) Shi H et al, Mol Cell 74 (18): 640-650, 2019 tRNA: Kaiser S et al, RNA Biol 14 (9): 1241-1251, 2017 • Metylované oblasti DNA jsou rozpoznávány proteinem MeCP2 (jeho doménou MBD - „methyl-DNA binding domain“) a dále specificky interagují (doménou TRD “transcriptional repressor domain“) s korepresorem Sin3, který přivádí k metylovaným oblastem HDACs. Metylace DNA a deacetylace histonů Rodina lidských proteinů vázajících metyl-CpG Di Croce, 2004 HDACs a represe transkripce A. přechodná represe B. stabilní represe  proliferující buňky: • cílové geny E2F jsou součástí euchromatinu • jsou regulovány cyklickými interakcemi s HATs a HDACs  diferencované buňky: • DNA cílových genů E2F je metylována • je součástí heterochromatinu Model regulace cílových genů E2F Model regulace cílových genů E2F Rettův syndrom  progresivní neurodegenerativní onemocnění, jedna z nejčastějších příčin mentální retardace žen  pacientky se vyvíjejí normálně až asi do 6. až 18. měsíce života; následuje zástava psychického vývoje, postupná ztráta řeči a dalších mentálních schopností, rozvoj autistických projevů  příčinou onemocnění je mutace v genu pro protein MeCP2, který rozpoznává metylované CpG sekvence  gen je lokalizován na chromozomu X (Xq28) Metylace DNA a stárnutí Field AE et al. DNA methylation clocks in aging: categories, causes, and consequences. Mol Cell 71: 882-895, 2018 Metylace DNA a stárnutí Field AE et al. DNA methylation clocks in aging: categories, causes, and consequences. Mol Cell 71: 882-895, 2018 Figure 3: Chronological versus Biological Age and Their Assessment by Methylation Clocks (A) Two people, blue and red, born at the same time, will always share the same chronological age (gray arrow timeline measured in years). However, because of genetic, epigenetic, and environmental factors and lifestyle choices, they may progress through the functional decline that characterizes biological aging at different rates. Shown here, red ages biologically more quickly than blue, likely associated with earlier onset of lethal disease. As illustrated, in early life, red and blue are assumed to have the same biological age. (B) By definition, a perfect chronological clock (left), whether based on DNA methylation or any other molecular parameter, measures time elapsed since birth. Therefore, it cannot distinguish between individuals that biologically age fast (red) or slow (blue). In contrast, a biological clock (center) can distinguish between unhealthy (red) versus healthy (blue) aging but is a less accurate chronological clock. A hybrid clock (right) tracks closely with chronological age, but deviation from the position of the 45° perfect chronological clock is a reflection of biological age. However, the hybrid clock is likely less accurate predictor of age and disease than bona fide biological clock. The human clocks calibrated against chronological age are likely hybrid clocks. The colors of the filled circles indicate the donor, red or blue, from (A). Kovalentní modifikace histonů - pokračování 14.11.2019