MOLEKULÁRNI BIOLOGIE PROKARYOT podzim 2018 KONJUGACE Ivana Mašlaňová iva.maslanova@gmail.com KONJUGACE Přenos DNA zprostředkovaný konjugativními plazmidy Pod pojmem konjugace rozumíme přenos DNA z donorové buňky do recipientní, k němuž dochází po jejich přímém kontaktu. Tento přenos je necitlivý k nukleázám. (Exkonjuganti - v rámci téhož druhu, transkonjuganti - v rámci různých druhů) Přenášené typy elementů (DNA): • Samopřenositelné (self-transmissible) plazmidy • Mobilizovatelné plazmidy • Chromozómová DNA • Konjugativní transpozony (+mobilizovatelné transpozony) transkonjugant (konjugant) KONJUGACE - HISTORIE 1947 - Joshua Lederberg, Edward Tatum - konjugace u E. coli, neznali přesnou podstatu konjugace bavlněná zátka tlak a podtlak U-trubice bakterie a b+ bakterie a+b tekuté médium s DNázou Filtrem nemohou procházet bakterie, ale viry a DNA ano Pokus s U-trubicí: důkaz, zda je pro přenos genů nutný kontakt buněk (Davies, 1950) Když se má v novém systému prokázat, že jde o konjugaci, musí se vyloučit alternativní způsoby přenosu, tj. transformace a transdukce. Pro vyloučení transformace se přidá DNáza, pro vyloučení transdukce se k recipientním buňkám přidá filtrát ze suspenze donorových buněk. Proces konjugace se liší u grampozitivních a gramnegativních bakterií. CHARAKTERISTICKÉ RYSY KONJUGACE 1. Jednosměrný přenos plazmidů, jednosměrný/obousměrný přenos chromozómových markerů 2. Je přenášen jen konjugativní plazmid, nebo dochází k mobilizaci dalších elementů (plazmidů, transpozonů, chromozomu) Výskyt konjugace u bakterií G- (enterobakterie) • prototypem je konjugace zprostředkovaná F-plazmidem • řada konjugativních R-plazmidů příbuzných F-plazmidu, mnoho jich má široké rozmezí hostitelů, např. RK2 (RP1, RP4) Další G-: Agrobacterium (Ti-plazmid), Pseudomonas G+ (enterokoky, stafylokoky, streptokoky, streptomycety) • prototypem je konjugace zprostředkovaná pADl • mnoho plazmidů má široké rozmezí hostitelů Konjugace u G- Nejvíce informací bylo získáno studiem přenosu F plazmidu a dalších plazmidů ze skupiny IncF u E. coli. Konjugace u konjugativních plazmidů je zprostředkována geny tra: • tvorba pilusů, na vnější straně buněk, nezbytné pro kontakt donorové a recipientní buňky. Pilusy: flexibilní (ohebné) a neohebné (tuhé) • plazmid tvoří flexibilní pilusy - používá se tekuté medium • neohebné pilusy - používá se pevný podklad • inkubaci přes noc - buňky smyty a přeneseny na selekční medium, kde vyrostou transkonjuganty (exkonjuganty). P donor F- recipient Conjugation F* donor Traniconjugant F* FUNKČNÍ OBLASTI F-PLAZMIDU SURFACE EXCLUSION ft SURFACE EXCLUSION .Q O > O oj pel us assembly 4— 1/1 c re PILIN TRANSCRIPTľON FACTOR CONTROLLER OF tra J REPRESSION OF tra O TRANSER ORIGIN INSERTION AND EXCISION O CT Q) to to to < ORIGIN OF VEGETATIVE REPLICATĚON F DNA REPLICATION INCOMPATIBILITY FinO imertionally inactivated \ IS 3a 3. RepFI - oblas replikace (3 oblasti) Tra> '\ finů Antijensť RNA E Immediately after entry Into coll A ±0 Activates pnar ově vzniklý konjugant přenáší plazmid do dalších buněk s vysokou účinností Pili and transfer funclions I tráT tTflX C After plaamld establishment FinP blocks translation: no Tra| Po ustavení plazmidu v buňce se exprimují všechny plazmidové geny plazmid se přenáší při nízké frekvenci a ci oriT LTu.VÍ rfui traY F nP :irP FinO :inO s-jbilii€s FinP flnO = negativní regulátor — répresor íinP = negativní regulátor — ^nüsense RNA Í.' F = erd = derspr^?ed mutant pi^nsd Charakter buněk F-, F+ a Hfr buňkaF~ buňkaF+ začleněný F-faktor buňkaHfr autonomní chromozom F-faktor chromozom chromozom ZPŮSOBY ZAČLENĚNÍ F PLAZMIDU DO CHROMOZOMU integrace nezávislá na RecA transpozice F-Faktor ::" Chromosom Transposase I I IS Element ► ori^ V chromozomu přítomnost IS2 a IS3 elementů - možnost homologní rekombinace, frekvence integrace nebo excize 10-4 integrace závislá na RecA homologní rekombinace F-Faktor í- Chromosom RecA-Protein 3zr CD IS-Element ^ etiT v chromozomu se objeví nová IS Vznik kmenů Hfr začleněním F plazmidu do různých míst chromozomu E. coli. Začlenění probíhá v místech IS. a Hfr-KmenI Hfr-Kmen II Hfr-Kmen III' Hfr-Kmen IV Obr. 64. Mechanismus vzniku různých typů Hfr-kmenů (viz text) Vznik buňky Hfr (HfrH) začleněním F-plazmidu do chromozomu E. coli F+ = Leu+ StrS F- = Leu- StrR Rekombinanty = Leu+ StrR IZOLACE KMENU HFR naředění, Leu+StrS ii (háření suspenze buněk F+ UV světlem 2) Preživšíbuňky půdu v takovsn vyrostlo asi SOqkoloni :+se vysejí na kompletn ředění, aby na plotně ' senaočkuje cer ;ivá Idu se streptomucinem A) Kolonie buněk F+se prerazftkujf á kultura F'Leu"Strr na plotnu s nárůstem buněk F" i i) Po 36 hodinách se obě plotny srovnávají Selektivní puda (Minimální půda + streptomycin) Kompletní puda Kolonie buněk Hfr Místa na minimální půdě vyznačující se hustým na'růstem představují rekombinanty Leu+Strr( které vaníkiy konjugací buněkF"sbuňkami Hfr přenese-'" nými na plotnu razítkem Křížení kmene F+ a F- DONOR Suspenze buněk F* ThrWBiďMerstr5 Konjugační směs RECIPIENT Suspenze buněk F~ Thr"Leu"Bio+Met+Strr Rozsev ha minimální Rozsev po 60 minutách Ro2sev na minimální syntetickou půdu konjugace na minimální, syntetickou půdu se streptomycinem syntetickou pudu se se streptomucinem streptomyctnenr) i Kolonie řekombinantních transkonjugantů Thr+Leu+Bio+Met+Strr Za vznik rekombinantu jsou zodpovědné buňky Hfr Křížení kmenů F+x F" buňky F •CD 1. V populaci buněk F+je nízká proporce buněk Hfr, v nichž je F plazmid začleněn do různých míst chromozomu 2. Volný F-plazmid se přenáší do F" buněk za vzniku buněk F+ 3. Z buněk Hfr se přenáší část chromozomu do F" buněk za vzniku rekombinant 4. Dochází k superinfekci rekombinant F plazmidem, v důsledku čehož výsledné rekombinanty obsahují F-plazmid Křížení přerušovanou konjugací 0 9 minu! po zahájení krížwii, 11 minut po lahájeni kříženi. O' 13 mitlu' P°zahájení kiiienl. Charakteristika přenosu: 1. Přenos začíná od oriT na F-plazmidu 2. Chromozomální geny jsou přenášeny v lineárním pořadí od oriT 3. Doba přenosu genů je úměrná jejich vzdálenosti od oriT 4. Pravděpodobnost přenosu genů klesá s jejich vzdáleností od oriT 5. Pravděpodobnost začlenění genů přenesených z donora do chromozomu recipienta je pro všechny přenesené geny stejná Q 25 minul po zahájení kitten I. přenosu rnarkeru dh přer^ ----n™rer!!?íjvaná k., (v: —, strS Po přenosu do recipientní buňky mají všechny geny stejnou pravděpodobnost začlenění do chromozomu (vyjma prvních 1-2') Geny thr a leu přenášené jako první (vysoká pravděpodobnost přenosu) Gen gal a další přenášené později (nízká pravděpodobnost přenosu) | Křivky vycházejí ze sledování průběhu konjugace v populaci gal leu thrl I Geny, které se nezačlení Četnost neselektovaných markerů u rekombinant thr+ strR při přerušované ■ ■ • • ■ r ■ v ' I • . I v v | | | v xv xv v konjugaci jako funkce časového intervalu, v nemz bylo knzeni přerušeno shrnutí výsledků 100 cd . čd + o ca 11 80 60 40 20 az/s ŕons • /ac+ gaŕ ± 10 20 30 40 50 doba v minutách před přerušením křížení 60 (a) interpretace výsledků počátek přenosu azis tons 9 11 18 25 doba přenosu (minuty) (b) <5 - 90 5 10 c3 / písB malT str t 80 \ O 4 ^ \ 20 pyrD HfrGtl 1 70 * a V* \ x Hfr KL19 / 30 / / / pyrC c5> 60 40 \ 4 \ 50 % a. Přenos genu probíhá v definovaném pořadí, může probíhat v obou směrech, a probíhá konstantnírychlostí45 kb/minutu. Celý chromozom E. co li se přenese za 100 minut. Sledování frekvence rekombinant při _použití různých kmenů Hfr_ Konkrétní přiklad nepřerušované konjugace Křížení: HfrH Leu'Pro+Lac+Gd+Trp+Stť x FLeuPro-LacGalTrp'Sty Selekce jednotlivých kategorií rekombinantů se provede na minimální půdě se streptomycinem a doplněné takto: Donorové a re-cipientní buňky se sm íchaj í, inkubují 60 minut a vysej í na plotny REKQMBiNAwn Půda FREKVENCE REKOMBINANTŮ 1. TmrWař : + pro, glu, trp 2. Pro+Strr : + leu, glu, try 3. Lac^Str : + leu, pro, lak, trp 4. GafStr" : + leu, pro,gal,trp 5. Tip^Str* : + leu, pro, glu 0,20 0,15 0,13 0,078 0,044 FREKVENCE REKOMBINANTŮ = počet rekombinantů daného typu počet buněk Hfr Odvozené pořadí genů na chromozomu kmene HfrH: O-Ieu-pro-lac-gal-trp Bakteriální chromoräóm f ReKombinace Excae Typu í F plazmid typ i F'plazmid Denafurace Renaíurace s F Meteroduplex se substiiucní smyčkou F plazmid £xcize ÍLjpuíí Vznik plazmidu F' typ I (IA n. IB) - plazmid obsahuje distální nebo proximální část bakteriálního chromozomu typ II - plazmid obsahuje proximální i distální část bakteriálního chromozomu Podíl chromozómové DNA v F'plazmidu může činit až 30% Beferoduplex s delecnf smyčkou Vznik plazmidů F' A B it C D Typ IA Typ IB TypII O IS-Element ► oriT TypIA ]| (f TyplB Jf A \ Typ 11 J B C v chromozomu zůstává část F plazmidu sfa = Sex factor affinity VZNIK F'PLAZMIDÜ HOMOLOGNÍ REKOMBINACÍ MEZI IDENTICKÝMI IS ELEMENTY E coli chromosome IS 7 \S2 V E. coli chromosome IS2 is; Různá konstituce a velikost F'plazmidö F' factor carrying chromosomal genes SELEKCE F'PLAZMIDU NA ZÁKLADĚ ČASNÉHO PŘENOSU pozdního MARKERU A. Kmen Hfr přenášející gen pro jako pozdní m arker. Při křížen í s kmenem F- bude gen pro přenášen zhruba po 60 m in utách. B. Vznik F'plazmidu se začleněným genem pro. Při křížení s kmenem F-bude F'pro přenesen během 5 minut. Výsledný zdánlivě rekombinantní kmen bude schopen gen pro dále přenášet při vysoké frekvenci Pro Parciální diploid Další možnost: použití recipienta recA" pparent recombinant Citliví k fágu M13 VZNIK DRUHOTNÝCH KMENŮ F' Prvotní kmen F' Přenos F'Iac do F Přechod do stavu Hfr (vysoká frekvence) Chová se jako Hfr Heterogenot F'lac/Iac Intermediární donor Druhotný kmen F' je diploidní pro alelu přenesenou F'plazmidem 9ret\os F*l*» V recipientu dochází s vysokou frekvencí k začleňování F'Iac do chromozomu a nebo výměně alely nesené F' (pak záměna alel) Přenos chromozomu MOBILIZACE Clone pieces randomly into a ran mobilii able-cloning vBctor Donor R-::ipic-ni onT Transform inlo cells containing a setf-transmissible plasmid (Amp' Cam^V QO) Amp' Cam' Malewrlh recipient; only onfT-oontaining plasmids are mobiliied (Cam' o c transconjuganLs Amp' O J O/iT ntifikace Části plazmidu klonovány do nepřenositelného vektoru s vhodným selekčním markerem (Amp). (IřIH_) c SeH-lransmissible plasmid encodes the MpF system, including a coupling protein Coupling protein signals lo relaitase of mobilizabHe plasmid Nick made at oriTof mobilizable plasmid 3 Mobilizable plasmid transtened Donorová buňka obsahuje dva plazmidy. F plazmid s tra geny -kontakt a přenos; a mobilizovatelný plazmid (modře). mob geny - jednořetězový zlom v oriT Přenos obou plazmidů. Mobilizable plasmid is replicated in the recipient (O o) (o ) MOBILIZACE NEKONJUGATIVNÍCH PLAZMIDŮ DONACÍ Nedochází k fyzickému kontaktu plazmidů Col nic tra mob nic = bom basis of mobility 90% C01+/F+ 5% C0I+/F- Mobilizace prostřednictvím příbuzných plazmidů Delece ori T nic pBR322 > PBR327 Mobilizace plazmidů kondukcí -dochází k fyzickému kontaktu obou plazmidů chromozom Přenos kointegrátu Kointegrát • Donor " DONOR Tvorba konjugačního páru RECIPIENT Rozklad kointegrátu (pX obsahuje transpozon) Recipient. pX = plazmid nemobilizovatelný donací Salmonella: mají řadu svých plazmidů, často fin+. Po jejich odstranění se do salmonely vnesly F plazmidy. U 5. typhimurium se F včleňuje jen do jednoho místa (místo sfa, jehož původ není znám) Pseudomonas: divergentní skupina druhů a kmenů, má řadu konjugačních systémů, samopřenositelných nebo mobilizovatelných. Plazmid FP2 může mobilizovat chromozom v jednom směru z jediného chromozómového místa. Byly popsány jiné plazmidy, mobilizující od jiných míst. Mechanismus mobilizace není znám. KONJUGACE U G+ BAKTERIÍ Konjugační přenos je znám u mnoha rodů: Bacillus, Enterocococus, Lactococcus, Staphylococcus a Streptomyces. Podobně jako u G- bakterií mohou být plazmidy přenášeny i mezi rody a druhy. Plazmidy stejně jako u G- kódují vlastní relaxázu a oriT. Plazmidy kódují geny pro postsegregační usmrcování buněk a partitioning. Kódují virulentní determinanty a geny pro ATB rezistenci, obsahují transpozony. Poskytují selekční výhodu hostitelským buňkám. Hlavní rozdíl v Mpf systému (chybějící vnější membrána u G+). Recipientní buňky produkují feromonům podobné látky - kontakt s donorovou buňkou. FEROMONY = malé peptidy stimulující párování buněk, expresy tra genů Zisk plazmidu vede k zastavení exprese genů pro FEROMONY. ROLE FEROMONŮ V PŘENOSU PLAZMIDŮ C Donor-induced B Donor-unindu-ced A. Feromony lokalizované na chromozomu recipienta. Pro-feromony ^ Feromony B. Plazmid donora exprimuje Tra A - represor tra genů kromě traC TraC - povrchový protein citlivý k feromonům Recipient cell C. Vazba feromonu na TraC -indukce -feromon se váže na represor Tra A A. Recipientní buňka tvoří feromony: geny pro feromony jsou umístěny na chromozomu. Feromony vznikají odštěpením signálních sekvencí z proferomonů (Pro-cADl) při jejich exportu z buňky. „Quorum sensing". Na povrchu se vytváří binding substance (BS). B. Donorová buňka: nese plazmid exprimující protein TraA (represor), který reprimuje transkripci tra genů vyjma traC, který kóduje povrchový protein TraC (receptor) zachytávající feromon. C. Indukce párování. Feromon se váže na TraC na povrchu donora a vstupuje do buňky, kde se váže na represor TraA, tím jej inaktivuje a navozuje tvorbu TraE, který pak aktivuje expresi tra genů včetně genu asa kódujícího agregační substanci (Asa) Asa - faktor virulence D. Přenos plazmidu. Donorová a recipientní buňka navážou kontakt a plazmid se přenese za vzniku transkonjuganta. E. V recipientní buňce (transkonjugantu) se přestává vytvářet zralý feromon. Inhibitorový peptid iADl se váže na TraC a zabraňuje párování dvou donorových buněk. TraB je inhibitorový protein, který brání exkreci feromonu. Mechanismy zábrany příjmu homologního plazmidu: Tvorba povrchových proteinů -exkluze vstupu Tvorba peptidů (iADl) zabraňujících vazbě feromonu Tvorba proteinů (TraB) -zábrana úpravy proferomonů a jeho exkrece Model konjugativního přenosu plazmidu u Streptoocccus faecalis Enterococcus (Streptococcus) faecalis Donorová buňka cOB1 Vazebná substance ndhezin Vazba na recipientní buňku Geny kódující sex-feromony Regulátorový gen, jehož produkt inaktivuje endogen Regulátorovy gen, jehož produkt řídí tvorbu agregační substance >cAD1 f FEROMON Recipientní buňka Feromony = hydrofobní okta- nebo heptapeptidy odvozené úpravami signálních sekvencí Iipoproteinových prekurzorů (7-8 aa z C-konce) sex-feromony streptokoků Plazmid Velikost (kb) Feromon pADl 59,6 CAD1 pOBl 1 71 C081 PPD1 54 CPD1 pAMyl \ 60 cAH-yl pAtty2 ~ 60 cAH-y2 pAHy3 - 60 cAHy3 pAM373 36 CAH373 pCFlO 54 CCF10 * Jeden kmen může tvořit více druhů feromonů a získávat tak různé plazmidy. * Plazmidy nesou geny pro tvorbu virulenčních faktorů, bakteriocinů a rezistence k antibiotikům * Plazmidy mohou být přenášeny do jiných druhů bakterií (Staphylococcus) Struktura plazmidu pAD1 (-60 kb) 39.6/0 m 30 KONJUGACE U STREPTOMYCET Development of a streptomycete colony including plasmid mediated conjugation. (A) Streptomycete spores. The chromosome is shown by gold lines. The chromosomes are linear, but the ends may be held together (see Box 1.1). The small dots indicate a conjugative plasmid such as the multicopy plJIOI. (B) Germinating spore. Hyphae begin to form when spores germinate. (C) A growing colony. Growing branching hyphae form so-called "substrate" mycelia. Growing hyphae contain very few cross walls, and so chromosomes (not shown) are not separated into individual compartments. During the transition from panel B to panel C, hyphal fusions may have occurred, allowing an opportunity for recombination between chromosomes from different parents. (D) Sporulat-ing mycelia. The vertically directed "aerial" hyphae have differentiated, forming chains of spores. As shown in panel D', the spores are haploid. A small percentage of the genomes will be recombinant, composed of segments of the different parental chromosomes (recombinants not shown). SPECIFICKÉ RYSY KONJUGATIVNIHO PŘENOSU U STREPTOMYCET D Konjugace nevyžaduje plazmidově-kódované geny pro kontakt buněk (hyf) D Není známo, zda přenos plazmidů nebo chromozómové DNA vyžaduje jednořetězcový zlom, a zda se přenáší jednořetězec D Chromozomy se přenášejí obousměrně, aniž v nich je plazmid začleněn: není pozorován gradient přenosu chromozómových genů D Plazmid pIJlOl kóduje jen jeden Tra-protein, který asi napomáhá přenosu DNA mezi hyfy. Po přenosu se plazmid velmi rychle v hyfech šíří. Letální zygoza - inhibice růstu recipientních buněk, do nichž byl konjugací přenesen plazmid - v okolí kolonie tvořené donorovou buňkou vznikají na nárůstu recipientních buněk poky (pocks) Závěry, které vyplynuly z prvních experimentů 1. Počet rekombinant přibývá s dobou trvání konjugace, lineárně až po dosažení vrcholu. 2. Různé markery jsou jsou přenášeny s různou frekvencí, když byly srovnány stejné doby trvání konjugace. Přenos z Hfr do F- probíhal řízeným způsobem (geny měly své přesné pořadí a přesný čas přenosu). Přenos chromozomu probíhal od pevného místa (ori) orientované. Závěr: pokud probíhá přenos chromozomu konstantní rychlostí, je doba přenosu genů úměrná vzdálenosti mezi nimi. To umožnilo použít minuty jako jednotky genové mapy.