Pulzní gelová elektroforéza • Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelové matrice. • Tento princip separace se uplatňuje u molekul DNA do velikosti přibližně 50 kb. • Větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí a nerozdělí se. • K jejich separaci se využívá pulzní gelová elektroforéza. • Gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90- 180°) v časových intervalech periodicky mění. • Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. • Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci více času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. • Techniky pulzní elektroforézy se využívá k separaci neporušených molekul DNA (např. chromozomů kvasinek) nebo restrikčních fragmentů o velikosti několika megabází. Základní termíny týkající se PFGE • Pulzní pole (pulsed field). Elektroforetický proces, který používá více než jedno elektrické pole, a ve kterém se elektrická pole střídavě aktivují. • Pulzní interval (switch interval, switch time, pulse time). Čas, po který je každé ze střídajících se elektrických polí aktivováno. • Reorientační úhel (reorientation angle). Úhel mezi dvěma střídajícimi se elektrickými poli, tj. úhel mezi různými směry, ve kterých molekuly DNA putují. • Homogenní pole (homogeneous field). Elektrické pole, které má uniformní potenciálové rozdíly po celém poli. Princip separace molekul v pulzním poli • A. Molekuly DNA o různých velikostech v prostředí bez elektrického pole • B. Separace molekul v konvenční gelové elektroforéze (molekuly o velikosti 50 - 500 kb se pohybují stejnou rychlostí) • C. Při pulzní elektroforéze je elektrické pole E1 přerušeno a nahrazeno polem E2 v jiném směru. Aby mohla DNA ve směru druhého pole migrovat, musí se nejdříve reorientovat ve směru u nového pole. Čím jsou molekuly větší, tím delší dobu spotřebují ke své reorientaci, a dochází tak ke zpomalení jejich pohybu. • Pokud jsou obě pole stejná (směr, napětí, pulzní časy), bude výsledná dráha pohybu přímá, složená z jednotlivých „cik-cak“ kroků. Pohyb DNA v agarózovém gelu při PFGE Označení systémů používaných pro pulzní elektroforézu • PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis • OFAGE Orthogonal Field Alteration Gel Electrophoresis • TAFE Transverse Alterating Field Electrophoresis • FIGE Field Inversion Gel Electrophoresis • CHEF Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis • RGE Rotating Gel Electrophoresis • ZIFE Zero-Integrated Field Electrophoresis • PHOGE Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis Součásti aparatury pro PFGE Příprava vzorků pro PFGE • Kultivace buněk do přesně stanovené hustoty • Smíchání buněk s roztavenou agarózou (107 buněk/ml) • Nalití směsi do malé formičky • lyze buněk v agarózových bločcích • deproteinace DNA • Promytí a odstranění proteinázy K (fenyl-metyl sulfonyl fluorid, PMSF) • Štěpení restrikční endonukleázou, která štěpí s nízkou frekvencí (velikost fragmentů 50 - 10 000 kbp) • Vlastní PFGE 5- 10 µg DNA v jamce • Barvení gelu v etidiumbromidu Schéma přípravy vzorků pro PFGE Buněčná kultura, jednobuněčné organizmy Živočišná nebo rostlinná tkáň Krev Shromáždit centrifugací Disociovat Koncentrovat bílé krvinky Promýt buněčnou suspenzi Stanovit koncentraci buněk a naředit na příslušnou hodnotu Smíchat buňky s nízkotající agarózou a nalít do formičky Štěpit proteiny proteinázou K v pufru s EDTA a detergenty Důkladně promýt v pufru s EDTA Alternativně odstranit proteinázu K pomocí PMSF Skladovat v pufru s EDTA Optimálně štěpit buněčnou stěnu Výběr vhodných restrikčních enzymů pro makrorestrikční analýzu DNA 1. Výběr na základě délky rozpoznávací sekvence RE Délka rozpoznávací sekvence by měla být ¥ 6 bp SfiI 5' GGCCN↓NGGCC 3' příklad RE s 10 bp rozpoznávací sekvencí I-SceI 5' TAGGG↓ATAA↑CAGGGTAAT 3' příklad intronem kódované endonukleázy s 18 bp dlouhou rozpoznávací sekvencí 2. Výběr na základě obsahu GC Bakteriální druhy se velice liší v obsahu GC v jejich genomech. Enzymy s GC-bohatou rozpoznávací sekvencí jsou vhodné pro AT-bohaté genomy SmaI 5' CCC↓GGG 3' NotI 5' GC↓GGCCGC 3' a enzymy s AT-bohatou rozpoznávací sekvencí jsou vhodné pro GC-bohaté genomy. SspI 5' AAT↓ATT 3' SwaI 5' ATTT↓AAAT 3' 3. Výskyt určitých sekvenčních motivů v rozpoznávací sekvenci Přítomnost sekvence odpovídající terminačnímu kodonu v rozpoznávacím místě RE může ovlivnit ftrekvenci štěpení. XbaI 5' T↓CTAGA 3' amber 4. Restrikční endonukleázy citlivé na metylaci typu CpG jsou vhodné eukaryotické DNA Některé enzymy neštěpí DNA jestliže se v rozpoznávacím místě vyskytuje 5-metylcytozin. MluI 5' A↓C* GC* GT 3' tento enzym štěpí savčí DNA méně často než SfiI Využití PFGE pro diagnostické a typizační účely – makrorestrikční analýza Volba pulzních intervalů v závislosti na velikosti separovaných molekul přesné hodnoty je možno uřčit pomocí softwaru Používané standardy velikostí pro PFGE • Konkatemery plazmidů • Konkatemery DNA fága lambda – Velikost monomeru 48,5 kb • Makrorestrikční fragmenty bakteriálních genomů – Staphylococcus aureus – Escherichia coli • Chromozomy kvasinek – Saccharomyces cerevisiae (240-2200 Kb) – Schizosaccharomyces pombe (3,5-5,7 Mb) – Hansenula wingei (1,0-3,1 Mb) – Candida albicans (1,0-4,0 Mb) • Chromozomy Dictyostelium discodium (3,6-9,0 Mb) • Chromozomy Neurospora crrassa (4,0-10,3 Mb) 25-90 s 1 800 s 60-120 s Pulzní časy Problémy při PFGE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Problémy při izolaci – nanášení vzorku – štěpení RE – nastavení PFGE 1. Optimální vzorek 2. Vysoká koncentrace buněk 3. Nízká koncentrace buněk 4. Nedokonalé promíchání buněk s agarózou 5. Degradace DNA při izolaci nebo štěpení 6. Bloček agarózy je v jamce vertikálně 7. Bloček se během nanášení rozlomil 8. Bloček je v jamce umístěný zešikma 9. Částečné štěpení DNA (vzorek vpravo) 10. Částečné ětěpení DNA v části bločku vyčnívající z pufru 11. Nedostatečné chlazení nebo není vodorovná podložka 12. Příliš krátké pulzní intervaly 13. Příliš dlouhé pulzní intervaly Kmeny Staphylococcus aureus Kmeny S. aureus • 8325, 8325-4=ISP, 8325-4 (77+), 8325-4 (53+) • ISP-8(53+), ISP-8 (77+), ISP-8 (91+), ISP-8 (47+) • ISP8 – bezprofágový kmen odvozený z PS47 • ISP8 (47+) – profág začleňující se do prvního fragmentu v makrorestrikčním spektru • ISP8 (53+) – profág začleňující se do druhého fragmentu v makrorestrikčním spektru • ISP8 (77+) – profág se SmaI místem v genomu začleňující se do pátého fragmentu v makrorestrikčním spektru • ISP8 (11+) – profág začleňující se do šestého fragmentu v makrorestrikčním spektru • PS47- tři profágy v genomu ϕ11, ϕ12 a ϕ13 • PS47 (77+) – čtyři profágy • PS47 (53+) – čtyři profágy Kmeny Staphylococcus aureus ISP8 PS47 PS47(53+) PS47(77+) 12 11 a 13 53 77