Rozložení skupin Skupina A - kmen Staphylococcus aureus ISP8-4F_A + kontrolní kmeny na test citlivosti k STR Dobře popisovat misky k rozlišení skupin 1. 24.9. - zahájení pokusu, příprava gradientních ploten (GrPL), očkování kultur, stanovení titru buněk a test na citlivost kmenů na STRE 2. 26.9. - vyhodnocení GrPL, CPM a testu citlivosti 3. 1.10.- čárkování „mutanť na plotny se STRE 4. 3. 10. - závěrečné vyhodnocení úlohy I. 5. Ve skupině rozdělit dílčí úkoly pro aktivitu každého člena skupiny 6. Hodnocení experimentů fotograficky, misky s gradienty po kultivaci i testy citlivosti stejně 7. Protokoly v pdf za skupinu s bohatou diskuzí výsledků elektronicky poslat na: vladkar@sci.muni.cz. •Skupina B - kmen Staphylococcus aureus ISP8-4F_B + kontrolní kmeny na test citlivosti k STR Skupina C - kmen Staphylococcus aureusSJR85^^ + kontrolní kmeny na test citlivosti k Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycínu metodou gradientních ploten Teoretický úvod: • Princip: Molekulární podstata spontánních a indukovaných mutací je stejná. Liší se však ve frekvenci. Frekvence spontánních mutací je podstatně nižší. Tím se také liší od fenotypové modifikace, neboť ta proběhne prakticky současně ve všech buňkách. Spontánní mutace -rezistence k antibiotikům probíhají dvěma způsoby. Buď se rezistence k antibiotikům vytvářejí postupně v několika stupních (napr. u penicilinu) nebo hned v prvním stupni získáme mutanty rezistentní k různým koncentracím antibiotika. Takto se vytváří rezistence k tetracyklínu. • Upozornění: očkování provádět ve sterilním prostředí flow-boxu; použitý materiál pečlivě roztřídit a odnést do umývárny. Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus citlivé ke streptomycinu Postup: První den. Z 18 hod. kultury vyrostlé na MPA agaru, odebrat 5 i více plných kliček a resuspendovat ve 3 ml MPB. Je nutno vyjít z husté bakteriální suspenze (cca 109 buněk/ml), protože frekvence STRE-R mutant je velmi nízká. Z takto pripravené husté kultury provést rozsev ze zředění 106, 10~7, 10~8 vždy na 3 plotny, pro stanovení celkového počtu buněk v cm3 (tj. titr buněk). Kultivace při 37 °C/20 hod. Připravit gradientní plotny se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50, 100 a 500 ug/ml (Obr. 1). Pozor! Musí být celá plocha zalita rovně! Pro přípravu zásobního roztoku rozpustit 0,4 g krystalického streptomycinu v 4 ml sterilní destilované vody. Získá se koncetrát ATB a ten se pak ředí dle účelu. (ATB přidávat do roztavené MPA půdy o teplotě max 55 °C). Provést rozsevy po 0,1 ml na gradientní plotny (vždy 2 plotny od příslušné koncentrace) a pečlivě rozetřít hokejkou po celé ploše (Obr. 2). Naočkované plotny inkubovat dnem vzhůru při 37 °C /24 hod (dle potřeby prodloužit čas). Obr. 1. Příprava gradientních ploten MPA 13 ml/PVC misky 15 ml/ skleněné 1 MPA nechat ztuhnout při laboratorní teplotě 2. A MPA + streptomycin 13 ml/PVC misky 15 ml/ skleněné označit ATB přidat do roztaveného MPA max. 55 °C Obr. 2. Izolace mutant z gradientních ploten Kulturu bakterií ředit v MPB Stanovení titru buněk rozsev na plotny s MPA -6 10 10" 10' I- I- —I --1 I- —I gradient) 2* 3* I 3* I 3x 10 18 hod kultura S. aureus Str s I Minimálně 5 kliček kultury 3 ml MPB hustá suspenze j t i t 50 100 roztěr hokejkou Kultivace při 37 °C 20 hod 500 ng/ml streptomycínu Test citlivosti kmene S. aureus k STRE - příprava ploten 0,7% W-j 1 denní kultura S, a. tuhý agar 45 ° C Kontrolní kmeny: Citlivý: Staphylococcus nepalensis CCM7045 Rezistentní: Staphylococcus aureus MRS A E9 Test citlivosti S. aureus ke STRE 25 ng/mk^. 10 \ig/m\ iílí! 500 ng/ml b/ 50 |ig/ml P. miska s MPA + inokulum S. aureus naočkované přes 0,7% MPA. 100 ng/ml Nakápnout ATB na misky 50 ng/m4-_. 25 \ig/m\ ^ Iii 75 ng/ml 500 jug/ml 100 ng/ml Inkubace při 37°C/ 20 hod. Hodnocení citlivosti kultury k ATB Vyfotit do protokolu !!!! Pokračování experimentu izolace spontánních mutant Příprava ploten na proužkování (připravit čerstvé plotny, ATB se rozkládá při delší úchově). • Do známého objemu roztaveného a vytemperovaného MPA na max. 55 °C přidat Vámi vypočítané množství zásobního roztoku streptomycínu tak, aby bylo dosaženo požadované výsledné koncentrace (Obr. 3). •Jednotlivé kolonie mutant přenést do mikrozkumavek s 0,5 ml MPB. Přeočkovat na plotny s různými koncentracemi streptomycínu (5, 10, 25, 50, 100 a 500 |jg/ml) formou proužků (Obr. 4). Pokračování pokusu - Varianta B) izolace mutant přes pasáž provést odběr 10 kolonií mutant a přeočkovat je na MPA-plotny 1,5% MPA Kultivovat při 37 °C 24 hod a poté uložit do chladu pokud se nedá pokračovat v pokuse. Obr. 3. Příprava ploten na proužkování ml Baňka obsahující rozvařený 1,5% MPA, vytém pérovaný na max. 55 °C. Přidat ze zásobního roztoku STRE na výslednou koncentraci, zamíchat a rozlít na Petriho misky. MPA + streptomycín 2x Po utuhnutí, označit koncentraci STRE a uložit do lednice Obr. 4. Ověření spontánních mutant proužkováním ze suspenze v MPB 5 pg/ml 10 pg/ml 50 pg/ml 100 pg/ml 500 pg/ml Na každou misku přidat 1 proužek kontrol, citl. a rezistentního kmene Inkubace při 37 °C po 20 hod Hodnocení pokusu • Z výsledků stanovit nejvyšší koncentraci, ke které je kmen rezistentní a určit mutační index (frekvence mutace) u jednotlivých koncentrací streptomycínu. • Výpočet mutačního indexu: FkoncATB = tÍtr mutant konc.ATB - titľ buněk • Vypracovat protokol (za skupinu): standardní členění: úvod, princip metody, materiál výsledky doplnit fotodokumentací diskuze a závěr Protokol ve formě pdf poslat na adresu: vladkar(Ssci.muni.cz Míchání ATB z 100 000 |jg/ml 10 000 1000 v H20 150 |jL/30ml_ 300[jL/30mL 150 [jL/30mL 300|jL/30mL 250|jL/50mL 500|jL/50mL 250|jL/50mL 500|JL/ 50 ml_ 500 (jg/mi 100 tig/mi 50 Mg/mi 10 Mg/mi