MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 Metodologie molekulární fylogeneze taxonomie hmyzu BÍ7770 Andrea Tóthová INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Metodické prístupy stanovení primárni struktury DNA Historie: 1953: štruktúra DNA (James Watson a Francis Crick; Nature, NC 1962) 1964: NC 1968 rozlúštení genetického kódu (Nirenberg M. a Matthaei H.) 1977: sekvenování chemickou degradací - neenzymatické štepení DNA (Allan Maxam a Walter Gilbert, P roc. Natl. Acad. Sci. USA) 1977: sekvenování terminátorovou metódou (Frederick Sanger, Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 1986: objev PCR (Mullis; NC, dr.h.c. LF MU) • Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., and Erlich H. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 51 Pt 1:263-373 • Aktuální stav: - 1996: sekvenování druhé generace - pyrosekvenování (Nyrén P., Ronaghi M. ; Stockholm), 454 sekvenování Roche/454, lllumina Genome Analyzer llx, Life Technologies SOUD 4 a další -21. století: sekvenování třetí generace - SMRT (single molecule real-time) - 2008; 2013 (Pacific Biosciences), nanotechnologie, hmotnostní spektrometrie, konfokální laserové spektrometrie a další • Výběr technologie závisí od plánovaného využití analýz MAXAM - GILBERTOVA METODA A. M. Maxam a W.Gilbert-1977 Sekvence DNA je vystavena určitým chemikáliím, které nasekají vlákno ve specifických místech (nukleotidech) Maxam-Gilbert • ds DNA • Radioaktivní značení 5'konce ds molekuly [y-32P] ATP (alkalická fosfatáza, polynukleotid kináza) • Denaturace a separace vláken • Chemická modifikace vlákna - metylace (G-dimetylsulfát, AT-kyselina mravenčí, CT-hydrazín, C-NaCI s hydrazínem) • Selekční štěpení metylací piperidinem • Elektroforéza • Autoradiografie • Vysoko radioaktivní látka, poločas rozpadu 14 dní, několik desítek bazí na gelu • Dnes se již nepoužívá Table 10.1 Specific Base Reactions in Maxai n-Gilbert Sequencing Chain breaks at: Base Modifier Reaction riim-1 mill at 25°C) G G + A T + C C Diniethylsiilphate Formic acid Hydrazine Hydrazine + sail w Mettiylates G Protonates purines Splits pyriniidine rings Splits only C rings 4 5 8 8 Figure 4A.4 Sequencing an oligonucleotide by the Maxam-Gilbert method 5 A T T G A G -A T T <3 A C Sample DNA Preparation of homogeneous single-strand DNA T T A G C C a' Addition of 32 P as 5' phosphate T T A C3 C C Cleavage at specific nucleotides G reaction A reaction, with some G cleavage (underlined) T reaction, with some G cleavage (underlined) C reaction 'ATTGACTTAGCC "ATTGACTTA *ATT Whole Fragment length ATP + SO/ D-luciferi n i (V A: 0%, C; SS%. G 0%, T 4S*/o G T a so P- dTTP 150 ■s LJ__>__I_Ll A. JC T G A O'S«.. G 03%. T: 36% G 1 SO so o JUL i U M C A C T G C P Pi dMDP AD P íJNMP AMP PPi Luc tferase. luciferi n-AMP + O, I lií..''".'.iSi' Luc i teraso + oxyluciferin + AMP + C03 +^hí^ T C* C A CfJl< '** J ŕ H T GT G C T'C TAC AC I JÜLLLI L. hpv ia \C<1T NucteolideaddilMW order CCD earrwra or phatomuliplicatof 1. Prime and Ligate 4. Cleave off Fluor Cle&vageAgenr ^ V , KOttt/ J............................- 5. Repeat steps 1-4 to Extend Sequence Ligation cyola I I 3 .1 (DCfclMl lllllllli" 11 "i11 ii>'1279_22_371_F3 TO 133231.3220220312223121011022022023113131. 112102 1 >12 79_35_172 9_F3 T10110133100 3203111312122132 21102021310210310331113 >1279_22 371_P3 23 20 S 13 11 22 28 -1 16 8 14 21 8 16 5 18 2 3 2 2 7 18 S 8 2 >12 79_35_1729_F3 24 18 13 23 7 7 20 7 13 7 5 8 3 11 6 26 28 20 5 25 10 8 5 3 ■4 %.^UJ» Přístrojové vybavení • Klasická vertikální elektroforéza • Gelové sekvenátory - plošné PAGE gely, ruční příprava - Applied Biosystems, Bio-Rad, Beckman • Kapilární sekvenátory - komerčně dostupné polymery -denaturační / nedenaturační, automatické „nanášení" vzorků, elektroforéza v kapiláře - (Applied Biosystems, Amersham Pharmacie BioTech, Beckman) • ABI PRISM 310, 3100, 3100-Avant, 3730, ABI 3500 Genetic Analyzer; MegaBACE 500, 750, 1000, 15000, 4000; CEQ 8000, CEQ 8800 • 1986 - 1. sekvenátor (Perkin-Elmer) • Gelové poloautomatické sekvenátory • Vývoj úrovně automatizace - princip kapilární elektroforézy • 1 -4-8-16-24-96kapilár • Vývoj ovládacího softwaru • Vývoj kvality, kvantity a rychlosti zpracování vzorků • Sekvenování první generace - Sanger - do 1000 bp • Sekvenování druhé generace - celogenomové - paralelní sekvenování amplifikovaného DNA templátu - 3 Gbp/run^20 Gbp/run -^100 Gbp/run • Sekvenování třetí generace - rychlé a dlouhé čtení -sekvenování jedné molekuly ABI Prism0 310 Genetic Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer Applied Biosystems 3130x/ Genetic Analyzer Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer Applied Biosystems 373CM DNA Analyzer Key applications: De novo sequencing • Resequencing • Mutation/heterozygote detection SIMP genotyping • Relative fluorescent quantitation • Micro sate I lite analysis • AFLP analysis Methylation analysis •T-RFLP analysis • MLST • BAC fingerprinting • SAGE™ ABI 310 ABI 3100 ABI 3100-Avant ABI 3700 ABI3130/XI. 370A SOLID SOLID PA ABI 3500/xl. Ion Torrent ABI 3730/xl. 1996 1998 2001 2003 2007 2009 2011 2010 Převzato od Martin Beránek, UKBD Hradec Králové ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer a metoda sekvenování • Automatický autosampler • Plata pro 96 vzorků • 4 kapiláry - paralelní runy • Pícka • Detekční prostor (laser, optika, CCD kamera, okénko kapiláry) • Katody a anoda • Elektroforetický pufr • Dávkování polymeru - systém stříkaček • Ovládací software o _ Status lights L On/Off button Doors Light switch - Tray button Reset button Upper polymer block Polymer-reserve syringe Array-fill syringe Oven Detection cell Capillary array Buffer and water reservoirs Autosampler !— Lower polymer block i— Anode buffer reservoir Electrode (anode) (+) Možnosti ABI Prism 3100- Avant Capillary Length Polymer Application Run Module Run Tim Resolution Pffonmnce KB Q20 LOR** High throughput SNP analysis SNP22_POP4 15 min 250 bp 22 cm POP-4™ High throughput, small size fragment analysis FragmentAnalysis22_POP4 20 min 400 bp 0.50 SD* - Standard SNP analysis SNP36_POP4 30 min 250 bp 36 cm Standard fragment analysis FragmentAnalysis36_POP4 45 min 400 bp 0.15 SDT - Ultra rapid sequencing UltraSeq36_POP4 40 min 500 bp 98.5%* 4O0 bp POP-6™ Rapid sequencing RapidSeq36_POP6 1 hr 500 bp POP-4™ Standard sequencing StdS»q50_POP4 1 hr 40 min - - 6O0 bp 50 cm Long fragment analysis FragmentAnalysis50_POP4 1 hr 5 min 500 bp 0.15 SDŤ POP-6™ Long fragment analysis FragmentAnalysis50_POP6 1 hr 30 min - Standard sequencing StdSeq50_POP6 2 hr 30 min 650 bp 98.5%* 6O0 bp 80 cm POP-4™ Long read sequencing LongSeq80_POP4 3 hr 40 min 950 bp / J 3130 capiuary array Princip metody sekvenování naABI Postup: purifikace DNA templátu - PCR amplifikace a přečištění produktu - cyklické sekvenování - přečištění sekvenační reakce - kapilární elektroforéza - analýza dat Dye terminator chemistry DENATURATION ANNEALING EXTENSION PRODUCTS ♦0 'A|g]t AC©# A C CiO ACCGfflt ACCGTiO AC CG TAfflf Templát - koncentrace, čistota Primer - specifita Pufr dNTP ddNTP Taq DNA polymeráza Dye primer chemistry DENATURATION ANNEALING EXTENSION Enzyme, dNTPs, reaction-specific ddNTP PRODUCTS c- ■H ■ A C C G T [Ä] A C[ A C C C C G LT] C C G T A X Princip práce stroje • Ovládání softwarem - DataCollection • Elektrokinetická injektáž - objem vzorku zůstává nezměněn • Pohyb fragmentů DNA gelem (polymerem) v elektrickém poli • Definování správných podmínek runu (modul) -bere v úvahu směs použitých fluorochromů, délku kapiláry (50-80 cm), polymer (POP6)... • Detekce emise fluoroforu při přechodu detekčním okénkem • Převod dat: spektra - raw data - elektroforetogram • Vyhodnocení a analýza Kl i I v [ 1 í i ;" : ] l: >\ ■ s X i í III! t r? r t r b. u iL iL . í~ — a. L í í I f * f i • Iii 2 í s í ' II -;—í- tl IfitJilillíili j; i I I -S 3 I |1 Š Ě B ng Analysis Software v5.1 I eft I . ►cape Software v2.T \A.a A AAa Maa AAaAa. a M/AAAa A/y\ AAA ,A A n . fWrt ^ a h A „ a/i a AAnA/lftArtAt ft A.A. A a <■, a aAa. /H^MaaMaAaaAAAaaaAaAAaAM aaaaaA/VVwvvV\Aa^ aaaA a a aa a AAA, /v4\ aAaA^ AaaAaAA AAaAAaa / W aaA aa/VVVV\ AA /WYi/V1-^ a A A A ••. •• .-. .'I ' ' •, •'. l'', .• •. AAA j'. .. '•. . a A A/i A a A.A. .. ."i •. i"i •■ jja .....II Settii-ig^'i.Boi-i^llviv Döcurrients'iKfistinalLaböi'atoh-'iLabiria'iSekvenatorl.Vy^ledky SEQ\2Q09|SEQ 110609 Iva'iIvaP'iRow data'iL: sequence scanners Coordinates (kj-J: I 44,6 I I.I I . . II I III I II . .Ill I II I ill I I III I II I I II I III I III III I II I III I I I I I . G A G T A A T C C T T G CT C A G AG G C T G T A A T G G C CAT G G G T T A C G A A G T G ACT G GT CACTAG dj P-. .3 Analyzed+Ram / Aplikace a využití metody sekvenování • Sekvenování de novo • Resekvenování • detekce mutací-SNP, INDELs (nutné rozklonování PCR produktů k detekcím jednotlivých alel) • evoluce genů • vnitrodruhové studie • mezidruhové studie Sequencher File Edit Select Contig Sequence View Window Help n JJQ ^ [ Overview Summary Cut Map Find Show Chromatograms ReAligner DAB 1*20 K5_374.2 K5_374 ÍSJ8 "K5_18.2 K5_619.2 Í65_619 K5_71.2 K5 71 GGGGTACACTGAACTTGGAGTATATAATGCAC GAAGATATAAC GGGGTACACTGAAcBTGGAGTATATAATGCAC GAAGAtBtAAC C. G BBBB: T G a a BJJT G a '7. T a T a T a a tJi: f|r r. a a a tBj a a '7 GGGGTAC AC T G A A C Br GljA GT AT AT A AT G C AC GAAGATATAAC GGGGTACACTGAAC Bj GGAGTATATAÁŤGČAC GAAGATATAAC GGGGTACACTGAAC Bj GGAGTATATAATGCAC GAAGATATAAC GGGGTAC AC TGAACP/TGGAGTATATAATGC AC GAAGATATAAC G G t^BH" i: Bj G r. a G T a T a T a a T G r a C G a a G a tBj a a '7 GGG^BatTÉTtrB^ck^&&AftírATATAAT&c AC gaagatBjaac gacgatcccaacattctgcagtcagc gacgatcccaacBttc.tgcaBtcag| gacgatcccaacBttctgc7aBtc,á.g| gacgatcccaacBttctgcagtcag| gacgatcccaacBttctgcagtcag| gacgatcccaacBttctgcagtcagI gacgatcccaacP/ttctgcagtcag! gacgatcccaacBttctgcagtcag| gacgatcccaacBttctgcagtcag| gagagctcaggtggatgcatactgcaaacaHaATGCTGAAATCAGACaggcagctatc gc IgagagBtc aggtggatgc atactgc aaac a jaat'gctBaamtmPJJJJc aggc ílgPJJIc gc JGAGAgBBc aggtggatgc atactgc aaac aba at g c BB^ AIITMBBBHGflc AgBtBBc gc jgagagctc aggtggatgc atäctgc aaac a_ía at g c t g a aBtBBbBc aggc agctatc g[ g '7. '7 t '7 a i7-17- t '7- '7- a t g '7 n t a >7 t '7- '7 a a a '7 a Ba a t '7- '7 t g a a Bt BBBhV A ':'':'a i7 i7 t a t '7 '7. 17- a '7- a '7. g t c a gg t '7- g a t g g n t a >7 t g '7 a a a g a Ba a t '7- c t g a a Bt BBBhV a g '7. >7 a g >7 t a t '7 '7. 17. G'7 7 '7 a i7- g1 g g at g c at a i7 t g '7 a a a c aha at g '7 t g a aBtBBBB~ a '"• '"•a '"'1 |i7- a '7- a '7. '7 t '7 a g g t '7- '7- Bt g g a t a g t g '7 a a a g a Ia a t '7- '7 t g a a Bt BBBfcV a '". g >7 a g g t a t '7 '7. gagagctcaggtggatgcatactgcaaaca~a at g c T g a aBt^^Hcaggcagctatc gc " I 2 0 ü I 2 1 ü I 2 2 0 I 2 3 0 ggggtacactgaacwtggagtatataatgcac gaagatwtaac I 2 40 I 2 5 0 1 2 6 0 1 2 7 0 I 2 8 0 I 29c GAC.GATC CCAACWTTCTGCAGTCAGMGAGAGCTCAGGTGGATGCATACTGCAAACAl I 3 0 0 I 3 1 0 X~3l iATGCTGAAMTMWRWCAGGCAGCTATC GC m jJID frag bases selected at consensus position 293 j; M UJ M HI C A T A C X5_18 Fragment base #260. Base 260 of 346 A A A C A M3 A A T G' k K5_18.2 Fragment base #260. Base 260 of 346 A A A r A MM A A T G M W Í65_619.2 Fragment base »240. Base 240 of 433 A A A r A bm A A T G X5_619 Fragment base #231. Base 231 of 424 A A C A bm A A T G K5_71.2 Fragment base #203. Base 203 of 433 A A A r A ■£■ A A T G k M 1LI X5_71 Fragment base #203. Base 203 of 434 Se que richer File Edit Select Contig Sequence View Window Help 0 vervie^Tj^urnrnary I" Cut Map Find Show Chromatograms ReAligner j X5_71.2 ) X5_619.2 ) X5_2D 1 X5 14 AC GACGATCC C A A C Jt/T C T G C A GT C A g|gA GA G C T C A G GT G g|t G C AT A C t G CAAACa(a ATGCtGAA AC GAC GATC C CAAC^TTCTGCAGTCAgJgAGAGCTCAGGTGGATGCATACTGCAAACa|aATGCTGAA AC.GAC ji'ATflc.C ÄÄCTTT CT G C AÖTC.A G'A GA GÄJJ.C T CJL G GT G G AT G C AT A C T G C A A A C AT A AT G C T GA A ACGACGATCCCAACATTC.TGCAGTCAGCGAGAGCTCAGGTGGATGCATACTGCAAACAGAATGCTGAA CAGGCAGCTATCGCTGATAAAACAGGTACAGCACAGGCTTCTGATC CTC CTG CAGGCAGCTATC GCTGATAAAACAGGTACAGCACAGGCTTCTgJfC CTC CTC &ÄG;GC:A&.C.TÄTCGCTGÄTAAAACAGGTACAGCACAGGCTTCTGATCCTCCTG CAGGC AGCTATC GCt|aTAAAACAGGTACAGC AC A G G C TT E.T;O.ATC c|c CTG 250 I 26 0 I27d I 2 80 I 2 90 I 3 0 0 I 310 ACGACGATCCCAACWTTCTGCAGTCAGMGAGAGCTCAGGTGGATGCATACTGCAAACAKAAT.GCTGAA1 I 33 0 I 3 4d I 3 50 I 3 60 ITtÖ :AGGCAGCTATCGCTGATAAAACAGGTACAGCACAGGCTTCTGATCCTCCTG m ■2S frag bases fl 7 consensus bases selected at consensus position 319 n at HQ A_C C H T H C T G A A A C A A_T H H H C H RRT G C >a 71.2 Fragment bases »218-224 HMT M II) R 11IC H G C_A T_A H G C T H T AT A A A A R T H H H H ta T T_G tht a n a a t K T_G a T M T T H 3 M5 618.2 Fragment bases »255-261 _A A BjUMBHWTMlMtyJ 1 H3TTaflailJVllJaT T G i a TAT 3 R T H T G T A 3 a H 3 T R T T T □a SS Sandier EHH File Edit Select Con tig 5eguence View Window Help + [ Overview Summary Cut Map Find 1 Show Chrornatograrns ReAligner 1 Maximize J ^g| SKR5392_MSTN_1JB_0C2_3432 SKR5391JVIS™jJA_001_3433 SKR5406JVIS™_9JB_004_3436 .SKR5405 IUISTN 9 1A 003 3136 TTAC C CTCTAACTGTGGACTTTGAAGCTTTTGGATGGGATTGGATTATTGCAC C CAAAAGATATAAGGC CAATTACTGCTCTGGAgHgi G TTACCCTCTAACTGTGGA C TTT GAA GCTTTTGGATGGGATTGGATTATTG;CAC C (a A-^^^AT AT A A G GC CAATTACTGCTCT G G A GgC- C TTTGTGTTTTTACAAA ia|a|ata| IGAGBGTGA: A:TTTGTGTTTTTACAAAAGTATCCTCA r gt Jtt| 3~Ö I 1 40 I 1 S 0 I 1 6 0 I 1 7 0 I 1 8 0 I 1 9 0 I 2 0 0 I 2 1 0 I 2 2 0 I 2 3 0 I 240 T^l TTAC GCTCTAACTGTGGACTTTGAAGCTTTTGGATGGGATTGGATTATTGCAC C CAAAAGATATAAGGC CAATTACTGCTCTGGAGgGTGAAATTTTGTGTTTTTACAAAAGTATC CTCAT 4 frag bases selected at consensus position 213 Li Ma ik JJQ T A W R R MMWWWYWS Y K - SKR5332_MSTN_1_1B_002 3432 Fragment base #218. Base 218 of 588 - T S K R G A G BM~ R T G A : A : T T T G TG T T T T T A C JE_A_ run H T W Y V I I M M IU 111 111 H 111 I HMr]HZMV3T 3 111 3 A 3 T T AAA3A3AAAHATa TT T T 3 H T f aAaaAAAaAMAAAaMMaMMaAAAAAAAa/ TATAAG GC CAA T TAC T G TATAAG GCCAATTACTG (\aa a a a A/\ Aa a a aa a a A SKR5391_MSTN_1_1A_001_3433 Fragment base #193. Base 193 of 564 CTGGAGWlGTGAAA TTT T TT T T C A C A T TATA AG GC CAA G C T C T GAGAGT GAAATT TT GT GTT TTCA CAAATA W R M -SKR5406 MSTH 9 1B 004 343B Fragment base #218. Base 218 of 587 • CTSKRG AR EST G TG A : A : T TTG TG TT TT J_ T A T 111 V V I ^atUUIlUHIllJHMuAZMV] T 3 III ] R ] TT AAA3A3AAAAATÜ" TT TT 3 A T A HID aa aa A A AVAAA a Aa A A at G C C A T T A C T SKRS40S_MSTN_9_1A_003_3436 Fragment base #196. Base 196 of 600 G G A G ■« G T GWRWW T T T K T T T W Y C A R W R A A A A HID ILI R W ILI T K T GTKT TUJVACAA R IU R aaaAaaAaaAA/U/AaAaaa/ Mikrosatelity - definice a využití • STR, SSR - jednoduché motivy, VNTR - složité motivy • Různé typy motivů v tandemovém opakování - Mononukleotidový motiv - jednoduchá repetice (polyA) (A)n - Dinukleotidový motiv - nejčasteiší v panelech v určování původu hospodářských zvířat (GT)n - Trinukleotidový motiv - vhodnější na odečet (panely u psů) - kombinace s di-nt motivy v panelech (GTC)n - Tetranukleotidový motiv - panely pro určování původu u zvířat i lidí, vhodné na odečet, ne tak časté (ATCT)n - Složené motivy - složité sekvence - zejména u nižších živočichů • Bythinella GA(CA)3(GACA)4(GA)2(CA)2(GA)22CA(GA)7CA(GA)4CA(GA)4CA(GA)7 • Gammarus [(CAT)2CACC(CAT)2C]2(CAT)2CACC(CAT)5G(CAT)2CACC(CAT)2 Polymorfismus na základě variability opakování -vysoce polymorfní Multialelické - zdroj genetické variability Klasické Mendelovské křížení a segregace Vznik nových alel - DNA pol. slippage, chyby v crossing-overu během meiózy Zejména v nekódujících oblastech - intergenové oblasti (genetický balast) a intragenové oblasti (UTR, introny) 15 CA repeats originally TTT TTT DNA replication >> i i'i .i ifiii.:. i i!rt:i vi 11| i i iJii^.; I I I I I I polymerase pauses in CA repeat domain DNA melts and reanneals incorrectly TTÍ Mutation 'repaired' incorrectly 17 CA repeats X_) I I I T_i~~|-T Funkce a využití MS • Funkce neověřená - ochotně rekombinují, tvoří sekundární struktury (vliv na replikaci DNA a buněčný cyklus), možná regulace genové aktivity (transkripce a translace) • Využití zejména: - v populačních studiích (struktura populace, fylogenetické analýzy, geografická vazba) - forenzní genetika (15 MS+amylogenin) - identifikace jedince (paternita, parentita, původ - i u zvířat - nutnost stanovení genetického profilu) - diagnostika a určování onemocnění (zvířata i lidi, vazbové markery) - konstrukce vazbových map (potřeba rodin a populací -existují již komerční kity např. ABI Prism Human Linkage Mapping Site) Velikost alel mikrosatelitních markerů a jejich variabilita • Variabilita v opakování motivu - variabilní délka amplifikovaného fragmentu • Možná modifikace (mutace) v místě nasedání primeru -falešná homozygozita, nulové alely • Možné chyby při PCR amplifikaci - sklouznutí DNA polymerázy, amplifikace nespecifického místa • Přidávání adeninu na konec fragmentu • Nestabilita při amplifikaci- polymeráza dělá čím dál tím kratší fragmenty C GTAG C CTTG C ATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT ATC G GTACTAC GTG G CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTATCGGTACTACGTGG Historie hodnocení variability mikrosatelitních markerů • Genealogie - tvorba rodokmenů • PCR amplifikace variabilních míst v genomu - horizontální gelová elektroforéza (EtBr) • Fragmentační analýza kapilární gelovou elektroforézou (fluorofory) Princip fragmentační analýzy kapilární elektroforézou FA-CE • Nezajímá nás sekvence fragmentů • Důležité - počet bazí (délka fragmentů), množství DNA (určuje výška píku) • Relativní size-ovací metoda - potřeba interního standardu (alignment by time scale/size scale) • Vícero píků+artefakty - nutno odlišit konkrétní alelu • 1 vs. vícero markerů - počet rozhoduje • Amplifikace polymorfního místa PCR (možnost multiplex) -důležitá kvalita a kvantita templátu (empirické stanovení) • Značení fragmentů pomocí značeného primeru (5'modifikace fluoroforem) • Separace amplifikovaných fragmentů v elektrickém poli kapilární gelovou elektroforézou • Príprava vzorku pro FA - denaturační činidlo (formamid)+interní standard velikosti fragmentů • Sekvenátor • Kapilára - 36 cm, polymer POP4, matrice a spektrální kalibrace pro daný modul FA • Ovládání softwarem - DataCollection • Elektrokinetická injektáž - objem vzorku zůstává nezměněn • Pohyb fragmentů DNA gelem • Definování správných podmínek runu (modul) - bere v úvahu směs použitých fluorochromů, délku kapiláry • Detekce emise fluoroforu při přechodu detekčním okénkem • Převod dat - spektra - raw data - elektroforetogram • Vyhodnocení a analýza - GeneScan + Genotyper, GeneMapper+PeakScanner Torre »1 -Scrvtea Hap r>BteVl3w| Huiview SWwView view] CepilfryViewl rBtruneni Oytdtton ■ Ltser On I EP on ■ Owen On ■ j t i. u:rJ 1 ■:«.«■, ■ (reBaistnroMiitui 004*06 =iuiTi™- mux FT 7 Ilia 1SO tea so ■260 "V. 309 J52 demo ■ q Hat) sjrBy LU»l|S 49 100 L«« Current r12j0 * ts=* ■00 Everts W At*1 218 « 2« fDT 20(01 5rt r\j> alfliuatoSTWTTI'W PMiriApr 121S 59 24PDT 2000] [ 2l«!tedaOW=ienFdnRu\_etann J1UD:ttDJU-12jl£ [WSrs Apr 12 11J59 23POT 30(10] Sendngririimdufcto the mstlijmert [Wld Apr 12 1S.T7 15 PDT 29D0] % cDnneclrttBcamimncBlionport ftteO Apr 1217 02 00 PDT 2000) % %r3JNPr^^£lff Ssgriiinrislnxlv IW601 Apr 1217 02 03 PDT 2000) % confront* reply pNWAprl2170236PDT 200O) 0VEM-rEMPERftrilfl£-T0LER6KCe 3.0 % SOvenltmotrtj-t Ovwt Temp :B50 isss [WBfJjJj» 13 IS 39 I E '.-1.111 : 'III Dye Sets, Dye Chemistry, and Applications: Dye Set Dye Chemistry Application Kit DS-30 (D) 6-FAM™ (blue). HEX™ (green). NED™ (yellow). ROX™ (red) * Linkage Mapping Sets-LD20, -MDtO. and -HD5 * Custom Oligos DS-31 (D) New 4-Dye Chemistry: 6-FAM (blue).VIC™ (green). NED (yellow), ROX (red) # Linkage Mapping Custom Oligos t Mouse Mapping Markers ♦ Custom Oligos DS-32 (F) 5-FAM™, JOE™, NED. * AmpFOTR* products ROX « Stockmarks™ DS-33 (G5) 6-FAM, VIC, NED. PET™. * AmpF/STR* Identifier™ 5-dye chemistry for high throughput genotyping LIZ™ * Custom Oligos DS-02 (E5) dR110,dR6G,dTAMRA™, dROX™, LIZ SNAPshot™ Multiplex Kit Condition NutnbGi': S.1 y Dala Source O varus: 1 Si * 1 . -J- ftiT ^fc j 1 All ju. v- j aůé J 1 lalal 1 IBS --- •■• *" z. 1 (um ^ MA 1 i_iiiröäl i.-J GeneMapper v 4.0. .H^ I-» H o 210 ■ ■ o >.=m ."-«u:i EE i _ ! .jIi J 1,1 lil jj • i I Kritéria pro tvorbu panelů MS markerů • Počet je rozhodující • Pokrytí celého genomu (téměř všechny chromosomy) • Co největší variabilita, množství alel • Vysoký PIC (polymorfní informační obsah) • Minimum nulových alel • Vhodnost pro multiplex-PCR • Velikostní rozpětí fragmentů alel, vliv na použití fluorochromu na značení • 6-FAM, NED, PET, ROX, HEX, VIC, JOE, LIZ - možnosti 4 a 5 dye systémů Typy MS panelů • Člověk • Skot, Prase, Kůň • Psi (10), dravci - sokol (tmavý, raroh, lovecký, stěhovavý), poštolka, orel (5), jelen, kočka • Ryby (různé rody i druhy) • Bezobratlí - šneci, blešivci, mravenci, mouchy etc.malé panely AmpfrSTR® Identifier™ i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i 0b;j 200 bp 300 bp 400 DflStl79 D21S11 D7SB20 CSF1PÖ D3S135B THOt D13S317 D16S5M D2S133S D19S43S vWA TROX D18S51 I II I I I II I GSSOQ-internal lane standard lokus chromozom fluorescenční značka barva rozsah (v bp) VHL20 30 FAM modrá 83-102 HTG4 9 FAM modrá 116-137 AHT4 24 FAM modrá 140-166 HMS7 1 FAM modrá 167-187 HTG6 15 VIC zelená 74-103 AHT5 6 VIC zelená 126-147 HMS6 4 VIC zelená 154-170 ASB23 3 VIC zelená 176-212 ASB2 15 VIC zelená 237-268 HTG10 21 NED žlutá 83-110 HTG7 4 NED žlutá 114-128 HMS3 9 NED žlutá 146-170 HMS2 10 NED žlutá 215-236 ASB17 2 PET červená 104-116 LEX3 X PET červená 137-160 HMS1 15 PET červená 166-178 CA425 28 PET červená 224-247 Možnost stanovit množství DNA pomocí FA • Nezaměňovat s kvantifikací pomocí qPCR • Určení množství amplikonu pomocí výšky a plochy píku • Nepřesné a relativní - hrozí „plato efekt" (vyčerpání systému) • Využívané při detekci onemocnění způsobenými polyploidií • Trisomie chromosomu 21 u lidí - Downův syndrom Uninforrnative u Normal (two alleles!; ratio between 0.8 and 1.4 Sekvenační reakce - příprava • Templát - PCR, BAC, plazmidový vektor, • Možnosti přečištění PCR - Kolony - Purifikace fragmentu z gelu - nespecifity nebo dimery primerů - SureClean • Možnosti stanovení koncentrace PCR produktu po purifikaci - Spektrofotometricky - Gelová elektroforéza - porovnání velikosti a koncentrace s markerem - Na základě fluorescence - Qubit - Nanodrop - kvalita i kvantita (koncentrace DNA při 260 nm, do up to 3700 ng/ul bez ředění) • Reagence sekvenační PCR - Typy sekvenačních kitů - Tabulka využití • Teplotní profil reakce - klasický vs. fast Přečištění PCR produktu |5 Wash Elute i f : 1 Excise g.ei slice -containing DNA fragment of interest. 2. Determine volume of go!. Add equal volume of Binding Buffer. 3-, Incubate at55°C-65°C 7 ruin or until gel rrnihts compietety. 4. Applysolutionto HiBind* extraction column assembled in 2m I collection tube. Centrifuge ai maximum speed 1 min at room temperature. Discard liquid. Wash column toice with 700 pi £PW Buffer diluted with ethartol, Contrifuge empty column 1 min at may speed to dry. Pisco column into clean 1.5 mi tuba and elute DNA with 3Ů-5Ů pi sterile watororTE buffer. Centrifugal min. OfillCilMll ilnn" ISlucOmii Plus attiyl AiM pin* ííci■ fLrpQ£rti»nE Al1:1 oil im-|u:iI v:>-.iiiki at tor 10 minutes Stanovení koncentrace Tamplaite Cycle Sequenchg Clttunistry BigDye Terminator vl.-l and vl 1 Big Dye XTerm inato r P li rificaUon Kit dGTP Big Dye Terminator v3.D dRhodamine Tetmhator Big Dye Prinor PGR product: 1 oo to 200 Dp soo to soo bp GOO to 1 □□□ bp i ooo to 2000 bp >2000 bp 1 to 3 ng 3 to 1 o ng 5 to 20 ng 10 to 40 ng 40 to 10O ng 0.5 to 3 ng 1 to 1 o ng 2 to EO ng 5 to 4u ng 10 to SO ng 1 to 3 ng 3 to 10 ng 3 to EO ng 1 O to 40 ng 40 to 10O ng 1 to 3 ng 3 to 1 o ng 3 to EO ng 10 to 40 ng 4u to 1 OO ng E to 5 ng S to 10 ng 10 to EO ng SO to SO ng so to 1 so ng Bisulfite converted genomic DNA-PCR prod uct 3 to 10 ng 3 to~10 ng not recommended not recom mended not recommended Single-stranded DNA SO to 10O ng 10 to SO ng SO to 10O ng so to 1 oo ng ISO to 400 ng Double-stranded □ NA SOO to SOO ng 30 to 3CIJ ng SOO to 500 ng SOO to SOO ng SOO to aoo ng Oosrmid. BAG O.S to 1 ^O ug soo to "1 .ooo ng 0.5 to 1 .0 i_i.g not recom mended 0.5 to 1 .O ug Bacterial genomic DMA £ to 3 ug 1 .OOO to 3.OOO ng 2 to 3 |j.g not recom mended not recommended einvitrogen Read tubes in Qubit fluorometer ■ «1 K ' where n - nunnfccrd Standards pLo n urrfecf d Samples | Nucleic Iddi Reagence sekvenační PCR a možnosti modifikace teplotního profilu Chemistry Options BigDye* BigDye® Applications Terminator Terminator »3.1 Kit vi.1 Kit Application BigDye Terminator v3.1 BigDye Twmiiiator vl.1 dGTP BigDye Terminator dRIiodamine Terminator BigDye Primer DNA Sequencing Application Bisulfite sequencing + ++ - - - de novo sequencing + / Comparative sequencing (gernnline mutations 50:50 hetflrozygotes) ++ ++ - + ++ Resequencing + / Sequencing difficult templates + + Long-read sequencing + / Comparative sequencing (somatic mutations 10:90 heterozygotes) - - - - + Comparative sequencing (somatic mutations 30: TO heterozygotes) + + - - ++ De now? sequencing ++ ++ + + + Sequencing across all template types . (Plasmids. PCR products. BACs: and fosmids) 1 * Gap closure (custom primers) ++ ++ + - Gene walking (custom primers] ++ ++ + + - Mixed-base detection + / Shotgun sequencing (universal primers. M13) ++ ++ + + ++ Sequencing short PCR products using . rapid electrophoresis run modules * DNA Sequence Context AT-rich >B5% ++ ++ - ++ ++ GC-rich >65*4 ++ ++ + + + + Recommended / Satisfactory Nové sekvenační kity BigDye Direct Cycle Sequencing Kit M13-tailed PCR primery Výhody vs. nevýhody GT-rich regions + + + + ++ ++ Honnopolymer A or T ?25 bp5 - - - ++ - Template Typ« BAC, cosmid, f osm id, lambda, large PCR product ++ ++ - + + Bacterial genomic DNA ++ ++ - - - Bisulfite-treated genomic DNA + ++ - - - PCR amplicon ++ ++ + ++ ++ PCR amplicon (heterozygous 10:90) - - - - + PCR Amplification 150 mm tZ5t\r) Clean-Up (Column or Bead-based) i 20 min (2 hr) Cycle Sequencing mmin (Ihr) Clean-Up (Ethanol Precipitation! 150 min (IShr) Detection and Data Analysis 120 mm (2hr) Traditional Method 690 min (11 hr 30 min) AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix Fast Method 245 10 Min 3 sec 3 sec _ . 10 sec ■» Below RecommendQd ExtGnsionTimQs: Length (Kb) Extension Time 0.5 5 sec 1.0 15 sec Big Dye* XTerminator™ Kit (4 hr 5 min) Denaturation ► Cycle Sequencing Hold Cyclo (25 Cycles) Hold 96'C 96'C 50'C 60*C 4'C 1 Min 10 sec 3 sec 75 sec 00 1.5 30 S£t Možnosti přečištění sekvenační reakce a príprava vzorku k analýze • Ethanol (inhibitor) • Kombinace kolony a ethanol - odstraní víc neinkorporovaných terminátorů • BigDye X-Terminator Kit - Není potřeba pracovat s formamidem (teratogen) - když zkrátíme dobu třepání, neubere tolik krátkých fragmentů - Platíčkové verze - minimum pipetování Start Separation Q Gd-rlrraionrrarflrid # Dva tarminaror (•j Dvj tarrninaror insida gal-Rllmri^n malarial BlgDye* XTermlnatorT" Purification Kit Workiiow Pei-form cycle sequencing T Prepare premiK and add BigDye^ XTerminator™ reagents to reaction plate T Vortex reaction plate I Centrifuge plate I Select appropriate run module in Data Collection software T Perform electrophoresis Thermal cy-slere 11 lil 9£-well plate 5ů4-waU ptarté Centrifuga :'!' í, T TGT '. . . • _- .'. H ';' ! G1 GCi iJSQ !'G '_\ G i CT ,'.CCC ,11.....rM.......i 1 1 IH 1 r . . , | P , , II. l4 Pi 1 N II 1 fc IM 1 1 1 1 PI . . ... . . . . -P 1 1 1 1 1 l| 1 E ■ ■■■ - ■, I mutt LI m* II .41 fi-t: ■■i. i »■> i i -. u >bi uHN Éi#l«»* - - ■■ i (ř* iu. a &3 « *> ■£ T» 3P ■ m it mi life i*j nf uu is sbih3 a. Scphadax Claaiiup i ... i. ii iii 111.....tit.....,.l..........iii!.......I i i I i I I I i i M i i I I i I i i i I) i. I i i i.......[ii ^aresH B. BiyDya"- ICTerHiiiiHlor™' Purification Cleanup 3790/-3-I30/31 00 instruments Příprava stroje před runem - běžný uživatel