Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu Bi7770 Andrea Tóthová MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 • Vertikální: kompletné genomy, hluboké, ale omezené informace • několik druhů a jedinců • úspěšně ukončeno u člověka, Drosophily a některých plodin • Horizontální: krátké cílené sekvence, plytké, ale široké informace • mnoho druhů a jedinců • např. DNA barcoding Dva pohledy genomiky • Problémy s konceptem druhu a jeho aplikacemi • Problémy s druhovou identifikací • Systém znaků – morfologie, genetika, atd. • Přístup k existujícím informacím • Snižování odbornosti • Snižování dostupných služeb • Genomika a Internet nabízí nové možnosti Historické výzvy Asociace vývojových stádií, zpracovaných částí a dimorfických pohlaví • DNA barcode je krátká genová sekvence standardizované části genomu použitá k druhové identifikaci Systém čárového kódu Interné ID pro všechny organizmy na Zemi • Tvoří species komplexy • Jejich parazitoidi (Tachinidae) také (Dittrich et al 2006) • Leguminivora ptychora na luštěninách je také species komplex • Ale někteří škůdci jsou široko rozšíření, např. Spoladea recurvalis a Maruca vitrata Příklad: Afričtí motýli Rychlé a efektivní • Čeleď Sphingidae – vzorky 49 druhů za 6 měsíců (téměř kompletní lokální fauna) • DNA barcoding rozlišil druhy jak v lokálním, tak v globálním měřítku • Místní knihovny můžou být rychle srovnány a přispět ke globálním knihovnám Jak Barcoding funguje Tvorba referenční knihovny: • Správně určený jedinec (vouchers) • Vzorek tkáně • DNA extrakce, PCR amplifikace • DNA sekvenování • Odeslání dat do GenBanku Použití referenční knihovny : • Neurčené druhy • Tkáň, DNA, sekvenování • Srovnání s referenčními sekvencemi Jak se to vše děje od jedince přes sekvenci po druh? CBOL – organizace členů od r. 2008 Více než 170 organizací z více než 50 zemí (z toho 54 organizací z 20 rozvojových zemí) 1. Vyvinout a zvednout standardy komunity 2. Barcode projekty plnit databáze 3. Globalní participace a koordinace 4. Přijetí taxonomickou komunitou 5. Koordinace s jinými oblastmi vědy 6. Přijetí regulačními agenturami 7. Vyvíjení produktů soukromými společnostmi Mise CBOLu: uvést DNA Barcoding jako globální standard Propojení GenBanku s vouchery • Fish Barcode of Life (FISH-BOL) - 30 000 mořských/sladkovodných druhů do r. 2010 • All Birds Barcoding Initiative (ABBI) - 10 000 druhů do r. 2010 • Tephritidae – 2 000 škůdců/prospěšných druhů do r. 2008 • Komáry - 3 300 druhů do r. 2008 • Ohrožené druhy • Trees of the world Globální projekty CBOL • CBOL staví na současných taxonomických poznatcích • Sequence knihovny založeny na voucher jedincích, co dělá vědu opakovatelnou a testovatelnou • Voucher jedince propojují historické, současné a budoucí výzkum Příklad: CSIRO studie na bzučivkách mapující rezistence na insekticidy a zjišťování historie pomocí DNA z muzejních jedinců (PNAS 103: 8757) Staré a nové techniky DNA Taxonomie – pomoc při řešení problému nebo vnášení chaosu? První záznamy COI do GenBanku – 1996, od té doby ca. 1000 sekvencí dvoukřídlých V současnosti – ca. 153 000 popsaných druhů dipter – méně než 1% je zařazeno do „Barcoding procesu“ Stanovení hranic druhu – podobnost sekvencí (pairwise distances) - PROBLÉM Světové sbírky hmyzu – nemožnost použít materiál pro analýzy - PROBLÉM COI nevhodný pro odlišení blízkých druhů Fylogenetická rekonstrukce příbuzenských vztahů – možné řešení – multigenový přístup Taxonomie založená výlučně/převážně na DNA analýze – zkreslený pohled Potřeba propojit s ostatními přístupy – INTEGRATIVNÍ TAXONOMIE GenBank • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ • Několik databází – Nucleotide, Protein, PubMed, CoreNucleotide, Structure, Genome, etc. • Věrohodnost sekvencí vyšší než v databázích CBOLu • Součástí je BLAST - „multialign tool“ Po zadání hesla – Insect… BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi FLY TREE 2004-2008, 30 mil. USD, 649 taxonů, desítky tisíc bp OUTPUTS Úprava sekvencí (alignment) - MEGA v. 10 vs MAFFT MAFFT v. 7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) MAFFT v. 7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) Alignment proveden v MAFFTu, exportován zpět do MEGA Proteinová translace pro ověření správnosti čtecího rámce Fylogenetické analýzy Metody FA – dva přístupy 1. Algoritmus – jde přímo k výsledku, co je jediný strom (odpadá srovnání vzájemně si konkurujících stromů) – metody shlukové analýzy (UPGMA), Neighbour-joining (NJ) – obě využívají data vzdáleností (distance) 2. Kritérium optimálnosti – dva kroky – definování kritéria, podle kterého je hodnocen každý strom určitým skóre, které se použije k následnému srovnání všech stromů - použití specifického algoritmu pro výpočet funkce (kritérium optimálnosti) a pro získání stromu s nejlepší hodnotou této funkce Fylogenetický strom – hypotéza, která vznikla co nejlepším odhadem na základe omezeného zdroje informací Jaká by měla vybraná metoda být? Výkonnost – „tempus fugit“ nebo „time is money“ pomoc – heuristické metody hledání v případe vyššího počtu taxonů či znaků Síla – kolik dat musíme shromáždit, aby byly výsledky správné Konzistence – s pridáváním dalších znaků spějeme k správnému výsledku Robustnost – do jakej míry vedou drobné odchýlky od vstupných předpokladů k nesprávným závěrům Falzifikovatelnost – určení nevhodnosti modelu na základě odchýlky od předpokladu IDEÁLNÍ METODA NEEXISTUJE… Metoda maximální parsimonie – úspornosti (MP) Jedna z nejpoužívanějších metod - rychlá, jednoduchá preferuje jednoduší hypotézy před složitějšími (široká filozofická platnost), tzn. vybere možnost (strom) s minimálním počtem evolučních kroků nutných k vysvětlení vstupních dat Ne všechny znaky jsou použitelné, parsimony - informative Dobrá pochopitelnost, jednoduchost, rychlost, nízký počet předpokladů (předpokládá, že jakákoli evoluční změna je vzácná, takže MP strom se dá považovat za nejlepší odhad skutečné evoluce) Nekonzistentnost, přitažlivost dlouhých větví (LBA) + - Metoda maximální pravděpodobnosti (Maximum likelihood, ML) - posuzují se jednotlivé hypotézy o evoluční historii zkoumaných taxonů z hlediska pravděpodobnosti, že jsou v souladu se získanými daty, výsledek – maximálně pravděpodobný odhad Tři součásti - vstupné data evoluční model fylogenetický strom s topologií i délkou větví Vysoká výpočetní náročnost při validaci vetví Nízka náchylnosť k chybě, robustnost vůči odchýlkám + Bayesian inference Výpočet pravděpodobnosti na základě specifikovaného modelu a na základě toho, co jsme o charakteru dat zjistili VÝHODY – menší časová náročnost, strom zohledňující fylogenetický signál v datasetu, možnost použít i pro smíšený dataset Princip přístupu jako u ML Základ – strom s danou topologií a délkami větví, model nukleotidových substitucí a rozložení substitučních frekvencí mezi jednotlivými nukleotidy Distanční metody Založené na podobnostech (vzdálenostech, rozdílech) Poznání skutečné evoluční vzdálenosti mezi všemi členy studovaného souboru taxonů umožňuje velmi lehkou rekonstrukci evoluční historie těchto taxonů Opakované změny jednoho znaku – korigované distance (jako u pravděpodobnosti) Nekorigovaná vzdálenost – p-distance Korekce: JC, F81, K2P, F84, GTR Předpříprava☺ • Úprava sekvencí (Sequencher v4.8) • Vytvoření alignmentu (MEGA) - .fas, .nex • Alignment v MAFFTu • Analýza MP (Paup) • Analýza NJ (Paup, MEGA) • Vytvoření souboru pro MrModeltest (PAUP) • MrModeltest • Příprava souboru pro MrBayes a ML (RAxML vs GARLI) • Využívání portálu CIPRES