C5720Biochemie 08-Nukleové kyseliny 9/16/2019 1 Petr Zbořil Obsah •Struktura nukleových kyselin, stavební kameny. •Báze a jejich tautomerní formy, nukleosidy, nukleotidy •DNA, RNA a její typy, jejich primární a sekundární struktury, komplementarita bazí. •Eukaryontní a prokaryontní genom. •Metody studia. Denaturace a renaturace DNA, hybridní struktury, chemické metody stanovení sekvence DNA (Maxam-Gilbertova metoda). • 9/16/2019 Petr Zbořil 2 Složení nukleových kyselin •Stavební kameny oDusíkaté báze – purinové, pyrimidinové oSacharid - pentosy ribosa, deoxyribosa oH3PO4 • Struktura oBáze + monosacharid = (d)Nukleosid o(d)Nukleosid + 5¢-fosfát = (d)Nukleotid o(d)Nukleosid – di a trifosfáty • • 9/16/2019 Petr Zbořil 3 Pentosy 9/16/2019 Petr Zbořil 4 • • • • • • • • • •Číslování pozic Báze - deriváty purinu a pyrimidinu • • • • • • • • •Číslování pozic •Vyskytují se 4 báze o2 purinové a 2 pyrimidinové oalternují thymin (obsažen v DNA, nikoli v RNA) a uracil (naopak) oDalší sporadicky se vyskytující báze • 9/16/2019 Petr Zbořil 5 Nukleosidy •N-glykosidy •Nomenklatura oAdenosin, guanosin oCytidin, thymidin, uridin oEv. deoxy- • • 9/16/2019 Petr Zbořil 6 Nukleotidy •Fosfátový ester na C5 •Nomenklatura – (d)Nukleosid(mono)fosfáty oAMP, GMP oCMP, TMP, UMP •Další fosforylace oanhydridy o(d)Nukleosiddifosfáty o(d)Nukleositrifosfáty • • • 9/16/2019 Petr Zbořil 7 Oligo- a polynukleotidy •Spojování nukleotidů oFosfodiesterová vazba oPotřeba energie •Sekvence nukleotidů – bazí oPrimární struktura oPotřeba informace •Směr čtení o5¢ a 3¢ konce • • 9/16/2019 Petr Zbořil 8 Formální řetězení nukleotidů •Fosfodiesterová vazba •Skutečná reakce složitější – energie • • • • 9/16/2019 Footer Text 9 Vyšší strukturní úrovně •Odlišnost DNA a RNA oVývojové aspekty - RNA svět oStabilita DNA •Chemické složení oDeoxyribosa x ribosa oThymin x uracil •Velikost molekuly oRNA relativně malé proti DNA oVýjimka RNA viry •Složitost struktury oDNA povšechně dimer o 9/16/2019 Petr Zbořil 10 Struktura DNA •Etapy •Chragaffova pravidla – poměr bazí v DNA A+G=T+C A=T G=C A+C=G+T • Donohue – báze v tautomerních ketoformách • Franklinová –RTG difrakční analýza • Watson, Crick (1953) – dvojšroubovice • 9/16/2019 Petr Zbořil 11 Struktura DNA •Komplementarita bazí oEnergeticky výhodné párování oH-můstky 2 u A-T, 3 u G-C oNení zcela automatické • • 9/16/2019 Footer Text 12 Struktura DNA •Sekundární struktura oŠroubovice •Vláknité molekuly •Dimer oAntiparalelní oMalý a velký ozářez •Jiné typy •šroubovic 9/16/2019 Footer Text 13 Struktura DNA •Poskládání molekuly DNA u eukaryontů oÚloha histonů oBazicita x fosfáty • 9/16/2019 Footer Text 14 Struktura RNA •Všeobecně jednovláknová oVýjimka některé viry • • • • •Srovnání RNA s DNA 9/16/2019 Footer Text 15 Formy RNA •mRNA omediátorová, messenger oinformační – 5-10 % •rRNA oribosomální – 80 % •tRNA otransferová, přenosová – 10-15 % o60 tRNA • 9/16/2019 Footer Text 16 Struktura t-RNA •Projekce do roviny oJetelový list •Typické úseky oOtevřené rameno oAntikodonové rameno oVariabilní – rozlišovací vl.astnost oNeobvyklé nukleotidy oVysoká specificita o • • 9/16/2019 Footer Text 17 Struktura t-RNA •Prostorová projekce •Typické úseky oOtevřené rameno oAntikodonové rameno • • 9/16/2019 Footer Text 18 Struktura rRNA •Jednovlákno s množstvím komplementárních úseků oTypické struktury – vlásenky aj. 9/16/2019 Footer Text 19 . Denaturace a renaturace DNA •Oddělování bazí – zánik H-můstků – vliv T oSvětelná absorpce vyšší u oddělených bazí, interakce ji snižuje oSledování procesu oddělování bazí - řetězců •Vratný proces oHybridizace řetězců •Nástroj studia – homologie •Metody – PCR, genové inženýrství aj. oPodle stupně oddělení o • • • 9/16/2019 Footer Text 20 . Denaturace a renaturace DNA •Spektra DNA •Proces denaturace DNA • 9/16/2019 Footer Text 21 Určení primární struktury • •Chemická metoda Maxam-Gilbertova •Specifické (téměř) štěpení řetězce činidly •Pracná, málo efektivní, ale univerzální a nezávislá oModifikace bazí – DMS – puriny ohydrazinolýza pyrimidinů •Štěpení řetězce v místě této báze oG – DMS, piperidin oA+G – kys. mravenčí, piperidin oT+C – hydrazin, piperidin oT – hydrazin + NaCl, piperidin • • 9/16/2019 Footer Text 22 Destrukce bazí a štěpení řetězců • • 9/16/2019 Footer Text 23 Sekvenace DNA •Schema metody •Ilustrace postupu oOd známe sekvence ok výsledku • 9/16/2019 Footer Text 24 Sekvenace DNA •Schema metody •Ilustrace postupu oOd výsledku k sekvenci • 9/16/2019 Footer Text 25 Syntéza oligonukleotidů •Syntéza na pevné fázi oMonomery s aktivovanými a ochráněnými skupinami oPrvní zakotven na nosiči oDeblokace reagujících skupin oVazba oPromývání oCyklický proces - automatizace •Příprava primerů oKomerční záležitost •Umělé geny • 9/16/2019 Footer Text 26 Syntéza oligonukleotidů •Fosforamiditinová metoda •Komerčně dostupné •oligonukleotidy – primery •Vlastní primery •Umělé geny •Modifikované geny • 9/16/2019 Footer Text 27 Syntéza oligonukleotidů •Umělé geny oDelší geny po částech • 9/16/2019 Footer Text 28 Table 12.3 Some Chemically Synthesized Genes Gene Size (bp) tRNA 126 α-Interferon 542 Secretin 81 γ-Interferon 453 Rhodopsin 1057 Proenkephalin 77 Connective tissue activating peptide III 280 Lysozyme 385 Tissue plasminogen activator 1610 c-Ha-ras 576 RNase T1 324 Cytochrome b 5 330 Bovine intestinal Ca-binding protein 298 Hirudin 226 RNase A 375