Adobe Systems ÚLOHA E 1 Stanovení genotypu a aktivity alkohol dehydrogenasy z krve C7195 - Pokročilé praktikum z biochemie Adobe Systems ÚLOHA E 2 Xenobiotika (xenos = cizí) • normálně se v organismu nevyskytují • nejsou nutné pro jeho zdravý vývoj • neslouží pro organismus jako zdroj energie. Primárním zdroje xenobiotik •chemický průmysl (PAH, PCB, benzen, fenoly, ....) •kouření (PAH, aromatické aminy, ….) •jídlo a alkohol (PAH, arylaminy, heterocyklické a aromatické aminy, .…) •aflatoxiny Adobe Systems ÚLOHA E 3 Silně lipofilní Lipofilní Polární Hydrofilní 1.Fáze biotransformace aktivace/inaktivace oxidace, redukce, hydrolýza 2. Fáze biotransformace aktivace/inaktivace konjugační reakce Akumulace v tukové tkáni Polární Hydrofilní Extracelulární tekutiny – exkrece játry, ledvinami Xenobiotikum Adobe Systems ÚLOHA E 4 • zavedení polární funkční skupiny do molekuly lipofilní látky - OH, -NH2, -SH, = CO, - COOH •reakce 1. fáze biotransformace: oxidace, redukce, hydrolýza •během 1. fáze biotransformace může docházet jak ke snížení tak ke zvýšení toxicity Nejčastější reakce je oxidace katalyzovaná: Øcytochrom P - 450 (CYP450) Øalkoholdehydrogenáza (ADH) Ømonoaminoxidázy a diaminoxidázy (MAO) 1. fáze biotransformace Adobe Systems ÚLOHA E 5 Cytochrom P450 Adobe Systems ÚLOHA E 6 Oxidace katalyzované CYP450 •Hydroxylace alifatických a aromatických uhlovodíků (benzén a jeho deriváty, PAHs, aflatoxiny, alkany, PCB) • Epoxidace nenasycené dvojné vazby (styrén, vinylchlorid) • Hydroxylace aminů (anilin) • -O, -N a –S dealkylace • Dehalogenace (PCB, formaldehyd, dibenzodioxiny, dibenzofurany) Adobe Systems ÚLOHA E 7 CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP3A4 CYP2C 2,3-epoxid 4,5-epoxid 9,10-epoxid 7,8-epoxid Fenoly 4,5-diol 9,10-diol 7,8-diol CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 7,8-diol-9,10-epoxid Glutathion-konjugáty GSTA1 GSTM1 GSTP1 DNA adukty tpoison 1-OH 3-OH 6-OH 7-OH 9-OH 9-OH-4,5-oxid 9-OH-4,5-diol DNA adukty tpoison B(a)P EH EH CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 EH Pokles aktivity má protektivní účinek Pokles aktivity nese vyšší riziko Adobe Systems ÚLOHA E 8 Oxidace alkoholu katalyzovaná enzymy alkohol dehydrogenáza (ADH) a aldehyd dehydrogenáza (ALDH) ethanol ADH (Alkohol dehydrogenáza) NAD+ NADH + H+ NAD+ NADH + H+ ALDH (Aldehyd dehydrogenáza) CYP2E1 Kataláza + H2O2 - H2O acetaldehyd k. octová Adobe Systems ÚLOHA E 9 Zkoumaný polymorfismus ADH1C (349 F/I) Studie ukázaly, že jedinci nesoucí alelu 350 I/I mají zvýšenou aktivitu ADH. Genotyp analyzován pomocí PCR a restrikční analýzy Restriktáza SspI rs698 - ADH1C*349Ile rs698F: GGCTAAGAAGTTTTCACTGGA rs698R: GCCGCTACTGTAGAATACAAAG Adobe Systems ÚLOHA E 10 Měření aktivity http://toxnet.nlm.nih.gov/png/138-89-6.png p-nitrosodimethyl anilin + NADH -----------à ???? http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b7/Pyrazole_structure.png Pyrazol – inhibitor reakce Adobe Systems ÚLOHA E 11 2. fáze biotransformace Obvyklé konjugační reakce: • konjugace s k. glukuronovou • sulfátová konjugace • glycinová konjugace • acetylace • metylace • glutathionová konjugace Obvyklé konjugační reakce: • konjugace s k. glukuronovou • sulfátová konjugace • glycinová konjugace • acetylace (N-acetyltransferáza) • metylace • glutathionová konjugace (Glutathion-S-transferáza) •Xenobiotikum se přes polární funkční skupinu navázanou v první fázi váže na vysokomolekulární endogenní konjugační činidlo •Konjugát má obvykle menší biologickou aktivitu, vyšší rozpustnost ve vodě a vyšší molekulovou hmotnost než původní látka (metabolit z 1. fáze) Adobe Systems ÚLOHA E 12 2. fáze biotransformace Acetylace pomocí N-acetyltransferáz (NAT1 a NAT2) •důležitá metabolická cesta pro látky obsahující aminoskupinu ve své molekule • arylaminy, heterocyklické a aromatické aminy, atd. Adobe Systems ÚLOHA E 13 NAT CYP1A2 CYP1A2 hydroxylamin hydroxylacetylamin Arylamin N-acetamid N-acetoxy-ester N-acetyl-acetoxy-ester tpoison tpoison Nitréniový ion DAC NAT DAC OAT NOAT OAT Adobe Systems ÚLOHA E 14 Konjugační reakce s glutathionem katalyzovaná Glutathion-S-transferázou (GST) + GSH GST •největší význam má membránově vázaná GST, protože se vyskytuje v blízkosti CYP450 = Glutathion (GSH) Glu Cys Gly