Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
1
Identifikaci jednotlivých druhů václavek
C7195 - Pokročilé praktikum z biochemie

Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
2
Úvod
•v Evropě bylo popsáno sedm druhů václavek:
A. borealis, A. cepistipes, A. ectypa,  A. gallica, A. mellea,A. ostoyae a A. tabescens
•hlavní ekologická funkce:
Dekompozice dřevní hmoty, ale velmi častý přechod k nekrotrofnímu parazitismu
•druhy hodnocené jako slabí parazité
A. borealis, A. ectypa, A. gallica and A. tabescens
•druhy hodnocené jako vážní parazité na stresovaných dřevinách
A. mellea, A. ostoyae and A. cepistipes

Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
3
Identifikace jednotlivých druhů václavek
Párové testy
Založeny na kompatibilitě neznámého izolátu s testovacím druhem
Časově náročné, v případě diploidních vzorků jsou výsledky často špatně interpretovatelné
Metody založené na analýze sekvence DNA
•RAPDs (random amplified polymorphic DNAs)
•RFLPs (restriction fragment length polymorphisms ) – IGS a ITS oblasti
•Sekvenace specifických oblastí
>
Nutnost čistého mycelia václavky nebo plodnic
>

Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
4
Identifikace jednotlivých druhů václavek na základě RFLP analýzy ITS oblasti
ITS2
Balicí papír
5.8S
rDNA
Malá jaderná rDNA
Velká jaderná rDNA
Umístění ITS oblasti a primerů ITS1, ITS4
ITS1
ITS4
ITS1
A. borealis
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAA-TCGTAGCATTG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT
G
A. ostoyae
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAA-TCGTAGCATTG-AGAGCTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT
G
A. gallica
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAAATCGTAGCATCG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT
G
A. cepistipes
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAACTTGAA-TCGTAGCATTG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCGACGT
G
A. tabescens
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAAACTTGAA-TCGTAGCATGGCAGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTTGAAGT
G
A. mellea
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAAACTTGAATTTGTAGCATTG-AGAACTGTTGCTGACCTGTTAAAGGGTATGTGCACGTTCAAAGT
G
              ****************************** *********** * ******* * ***
**********************************  * ***
A. borealis
TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGATTAACTTTCGCTCTCGAG--CGGTTAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT
C
A. ostoyae
TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGGTTAACTTTCGCTCTCGAG--CGGTTAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT
C
A. gallica
TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGATTAACTTTCGCTCTCGAG--CGGTTAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT
C
A. cepistipes
TTGCG--TTCTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGATTAACTTTCGCTTTCGAG--CGGTTAGAAGGGCTGCTTTC---------GAGCT
C
A. tabescens
TTGCG--TTTTATTC--ATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGGTTAACTTTCGCTCCAAGGGCTGGATAGAAGGGTTGCTTTC---------GAGCT
C
A. mellea
TTACGGGTTCTGTTCTAATCCACCTGTGCACCTTTGTAGACTTGGTTAAGCTTCGCTTTCGAG--CGGTTTGAAGGGTTGCTTGCTTTCGAGCTAAGCT
C
              ** **  ** * ***  ********************************* ******     *   ** * ****** *****
*          *****
A. borealis
CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTC-TTTAAATCTTATACAACTTTCAACA
A
A. ostoyae
CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTTTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTCCTTTAAATCTTATACAACTTTCAACA
A
A. gallica
CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTCCTTTAAATCTTATACAACTTTCAACA
A
A. cepistipes
CCTTTGTCT-ATCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATGGGACGCAAGTC-TTTAAATCTTATACAACTTTCAACA
A
A. tabescens
CCTTTGTCTTACCAAGTCTATGTCTATATAATCTCTTGTATGTCTAGAATGTCTTGTTTATAGGACGCAAGTCCTTTAAATCTTATACAACTTTCAACA
A
A. mellea
CGTTTGTCTTACCGAGTCTATGTCTATATAAACTTTTGTATGTTTAGAATGTCTTGTTTATAGGACGCAAGTC-TTTAAATGTTATACAACTTTCAACA
A
              ********* ************* ********** ******** ***************** *********** *******
******************
AR1
Sekvenční homologie ITS1 oblasti

Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
5
Identifikace jednotlivých druhů václavek na základě RFLP analýzy ITS oblasti
Primer
Sekvence (5‘    3‘)
Délka
Amplikon (bp)
Tm (°C)b
AR1
CTGACCTGTTAAAGGGTATGTGC
23 b
690-724
59.94
AR2
AAGCTGAATCCTTCTACAAAGTCAA
25 b
59.85
bTm byla vypočtena programem Primer 3
AR1
ITS2
5.8S
rDNA
ITS1
AR2
ITS oblast
>
Lochman, J., Serý, O. and Mikes, V. (2004) The rapid identification of European Armillaria species
from soil
samples by nested PCR. FEMS Mcrobiology Letters 237, 105-110.

Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
6
Identifikace václavek se vzorků půdy
• Izolace DNA z 0.2g půdy pomocí kitu (Soil,Qiagen)
A260/280= 1.8
•Nested PCR reakce s vnějšími primery ITS1, ITS4 a vnitřními primery AR1, AR2
1 krok
2 krok

Adobe Systems
ÚLOHA VÁCLAVKY
7
Délky amplikonů a restrikčních fragmentů
Izolát
Délka amplikonu (bp)
ITS/AR
Restrikční fragment HinfI (bp)
A. borealis A1a
868/711
293, 172, 56, 31, 75, 68
A. cepistipes 204b
868/711
293, 227, 43, 132
A. gallica 147 b
868/711
294, 227, 43, 63, 69
A. mellea 184 b
882/724
148, 159, 401
A. ostoyae C2 a
870/713
294, 228, 31, 75, 69
A. tabescens T3 a
847/690
295, 125, 93, 32, 129