INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 1 VYBRANÉ METODY VYUŽÍVANÉ KE STUDIU GENOMU ARABIDOPSIS THALIANA A K PROVÁDĚNÍ CÍLENÝCH ZMĚN, SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ Úvod Dopolední část bude věnována analýze aktivity promotorů pomocí transkripční ffize a chemicky indukovatelného transkripčního aktivačního systému a dále praktickému osvojení softwaru pro design sekvence oligonukleotidů OLIGO 6 včetně navržení sekvence PCR primerů. Odpolední část zahrne vlastní syntézu, purifikaci a kontrolu kvality PCR primer a přípravu experimentu pro tranzientní expresi proteinů v tabákových rostlinách. Časový harmonogram1 7:45 Sraz v učebně A2/1.21 7:50 Zahájení semináře (Jan Hejátko), UKB, Kamenice 5, budova A2, místnost 1.21 8:00 PŘÍPRAVA MATERIÁLU (Jan Hejátko), laboratoř 334 8:15 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko) 1. Teoretický úvod 2. Zahájení barvení 9:00 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 1. Teoretický úvod 2. Zahájení indukce dexametazonem 10:05 DESIGN SEKVENCE PCR PRIMERŮ (Hana Konečná), místnost 1.21 11:00 Kontrola barvení 11:15 DESIGN SEKVENCE PCR PRIMERŮ (Hana Konečná), místnost 1.21 11:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 3. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 11:45 - 12:45 OBĚD 12:45 SYNTÉZA OLIGONUKLEOTIDŮ (Hana Konečná), Centrální laboratoř 342 14:00 ANALÝZA BUNĚČNÉ LOKALIZACE PROTEINŮ (Markéta Šámalová), laboratoř 334 Infiltrace listů tabáku 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 1. DNE 1 jednotlivé časy se mohou měnit podle potřeby a rychlosti zvládnutí jednotlivých metod 1 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Příprava materiálu Pro práci v laboratoři se seznámíme s organizací práce, přístroji a připravíme materiál a roztoky. Práce v laboratoři • Bezpečnost • Zdroje vody • Základní chemikálie • Odměřování a pipetování • Skladování • Odpady a použitý materiál • Sterilizace Přesvědčte se, že máte k dispozici následující chemikálie a materiály: • ddH20 (sterilní, 50ml) • 70% etanol /100% etanol • Špičky/zkumavky (sterilní) • Pinzetu • Barvící pufr a destičky • Tužky, fixy, popisovači nálepky Komponenty PCR reakce. V krabičce označené číslem vaší skupiny jsou uložené následující chemikálie: • Taq DNA polymeráza • lOx koncentrovaný PCR pufr s MgCh • dNTP • primery Metoda 1A Analýza aktivity promotoru pomocí transkripciu' fůze s reportérovým genem uidA (GUS) 1) Rozpipetujte si připravený barvící roztok do barvící destičky (2 ml) 2) Vložte připravené semenáčky (cca 10-15 kusů) pomocí jemné pinzety do barvícího pufru 3) Proveďte infiltraci v exsikátoru (15 min.) 4) Vložte do termostatu (37 °C) . 5) V cca dvouhodinových intervalech provádějte kontrolu barvení pomocí stereomikroskopu. 6) Barvení zastavte pomocí 80 % etanolu, ve kterém ponechejte semenáčky odbarvovat při pokojové teplotě do druhého dne. 7) Vyměňte etanol a opět nechte odbarvovat (2. den, úterý). 8) Proveďte projasňování semenáčků (4. den, čtvrtek). 9) Opatrně přeneste projasněné semenáčky na sklíčka a připravte preparáty pro automatickou mikroskopii (4. den, čtvrtek). 10) Spuštění automatického mikroskopu (přes noc;4. den, čtvrtek). 11) Vyhodnocení výsledků barvení (5. den, pátek). 2 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Použité transgenní linie: ProCYCBl:GUS (sk. 1+4) ProARR5:GUS (sk. 2+5) ProAHK4:GUS (sk. 3+6) Složení barvícího roztoku: X-Glc 0,01% (w/v) Triton X100 0,1% (v/v) Pipufr, pH6,9 0,1M K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 0.5 mM X-Glc - navazuje se ráno před cvičením Triton XI00 - 200 ul 1% tritonu na jamku, nebo - 20 ul 10% tritonu na jamku Pi pufr - 2 ml 0,lMPi na jamku komponenta A - 6,899 g NaH2P04.H20 v 100 ml H20 komponenta B - 8,889 g Na2HP04.2H20 v 100 ml H2O 7,8 ml komponenty A + 12,2 ml komponenty B + 80 ml H2O = 100 ml Pi pufru (lednice) Fe soli - 20 ul zásobního roztoku na jamku 1,646 g K3[Fe(CN)6] + 2,112 g K4[Fe(CN)6] + 50 ml H2O =50 mM zásobní roztok 3 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Schéma nej důležitějších morfologických a anatomických částí semenáčku Arabidopsis thaliana. PRAVÉ LISTY DĚLOŽNÍ LÍSTKY (KOTYLEDONY) APIKÁLNÍ MERISTÉM PRÝTU 4 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Analýza aktivity promotoru pomocí transkripční fůze2 a dexametazonem indukovatelný transkripční aktivační systém. Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr: 2 Do protokolu zejména uveďte: název genu analyzovaného promotoru, stručný popis principu metody, zda se podařilo identifikovat místa specifické aktivity daného promotoru (uveďte stručný výčet barvených pletiv) a co lze z tohoto výsledku uzavřít, příp. pro co jej dále použít. 5 EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání /^W^ľ7 MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost MNA.» li INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 1B Dexametazonem indukovatelny transkripční aktivační systém Použití chemicky indukovatelných systémů pro expresi transgenů je zásadním požadavkem moderního biologického výzkumu (nejen) rostlin. V našem experimentu použijeme přísně regulovaný a vysoce citlivý genový expresní systém pOpó/LhGR (Samalova et al, 2005, Plánt J 41: 919-935). který je indukovatelny dexametazonem. Tento systém obsahuje transkripční aktivátor LhGR a chimérický promotor pOp, který se skládá z lac operátorů nakloňovaných před minimálním promotorem CaMV35S. Po indukci se aktivátor LhGR naváže na pOp promotor a indukuje z něj expresi požadovaného cílového genu (viz obr. 1). Bylo vyvinuto několik chemicky indukovatelných systémů (viz přehled Moore et al., 2006. Plánt J 45: 651-683). Avšak pro ideální systém je zapotřebí řady vlastností, jako jsou velmi nízké hladiny bazálni (neindukované) exprese, vysoká indukovatelnost, specifičnost a dynamický rozsah odezvy vůči induktoru, žádoucí je také rychlá odpověď a indukce různými metodami. Ideální systém by měl fungovat u několika druhů organismů a neměl by vyvolávat žádné nežádoucí fyziologické účinky, sám o sobě nebo jeho induktor. Pro induktor je dále požadováno, aby pro transgen vykazoval vysokou specifičnost, vysokou účinnost při nízkých koncentracích a nesmí být nalezen v cílových organismech, a proto jsou složky pro tyto systémy obvykle odvozeny z nepříbuzných druhů. Obr. 1 ACTIVATO Tissue specific DNA- transcription promoter binding d. activation d. REPORTER tec TATA operators box BMI ^k. GR |_ac|(H,S17) Gal4 um Gene of interest m f HSP90 I. 1) Opatrnb^mistete semenačka (přibližré 10-15 kusů) z dané Pe^jiho misky do roztoku, imetaBn nebo Mntrc" \fCj° dobu 24 Iiul který buď obsahuje dexametaMn nebo SntrofnPfBzpouštědlo (Iftf §. 2) Nechte indukci pokraó; {(jo dobu 24 liudin na piatuvhím (ie inkubátoru v rostlinném 3) Následující den proveďte GUS barvení a analýzu jako v metodě 1A. 4) Pro vypracování protokolu: a) Vyhodnoťte výsledky barvení. b) Popište výhody používání indukovatelných systémů nad konstitutivními promotory. Metoda 1C Infiltrace agrobakterií do listů tabáku Nicotiana benthamiana 6 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Listy tabáku Nicotina benthamiana jsou vhodným rostlinným systémem pro transientní expresi různí ch proteinů, u kterých chceme studovat jejich vzájemné interakce a lokalizaci uvnitř rostlinné buňky. K transformaci listu využijeme přenos T-DNA z Agrobacterium tumefaciens. Studované geny jsou nakloňovány do expresní kazety uvnitř T-DNA oblasti binárního plasmidu a takto připravené konstrukty pro expresi fúzních proteinů (s GFP, RFP, YFP-N, YFP-C apod.) jsou transformovány do kmenu GV3101 pMP90. Vzniklé kmeny agrobakterií potom kultivujeme a ve formě suspenze je pomocí injekční stříkačky (bez jehly) vtlačíme skrze průduchy na spodní straně listu do mezofylového prostoru. Následně dojde k přenosu mnoha kopí T-DNA do jádra buněk. Pro transkripci vnesených genů není nutné začlenění T-DNA do chromozomů. Pokud před infiltrací smícháme kmeny nesoucí různé konstrukty, dojde s velkou pravděpodobností k jejich koexpresi, protože jedna buňka je zpravidla transformována mnoha agrobakteriemi současně. Avšak k dosažení koordinované exprese dvou proteinů je výhodnější spojit je peptidem se samo-štěpícími se vlastnostmi, jako je např. 2A peptid izolovaný z FMDV (Samalova et al., 2006, Traffic 7: 1701-1723). Transientní exprese proteinů je většinou velmi silná kvůli velkému počtu transkripčně aktivních kopií T-DNA v jádře, ale během několika dnů (3-4) odezní. Každá skupina si vezme 2 zkumavky s narostlou agrobakteriální kulturou podle následujícího rozpisu: Skupina 1 Skupina 2 Skupina 3 Skupina 4 Skupina 5 Skupina 6 2A 9-3 2A 4-2 2A3-2 2A 8-3 2A3-5 2A 2-4 2A 2-4 2A 8-3 2A3-5 2A 3-2 2A 9-3 2A 4-2 1. Přeneste 1,5 ml od každé kultury do eppendorfové zkumavky (nezapomeňte ji označit!). 2. Centrifugujte zkumavky rychlostí 4000 ot/min po dobu 5 minut. 3. Během centrifugace připravte 25 ml infiltračního pufru (IB): Infiltrační pufr (25 ml) lOx IB 2.5 ml destilovaná voda do 25ml 1M Acetosyringon 5 ul 4. Supernatant odsajte pipetou. 5. Přidejte 1 ml připraveného IB do buněk a znovu je resuspendujte. 6. Centrifugujte zkumavky při 13000 ot/min po dobu 45-60 s a odsajte supernatant. 7. Zopakujte krok promývání (body 5 a 6). 8. Resuspendujte buňky v 1 ml IB. 9. Nařeďte 1/5 (200 ul buněk v 800 ul IB) v kyvetě pro spektrofotometr. 10. Změřte ODôoo a připravte 1 ml směsi ODôoo = 0,2 pro infiltraci tabáku. Požadované OD600 x 1000 = ul 1/5 zředění se přidá do 1 ml IB ODôoo 1/5 zředění Infiltrujte suspenze pomocí injekční stříkačky o objemu 1 ml (bez jehly) přes spodní stranu listu do připravených tabákových rostlin. 7 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Vezměte rostliny do skleníku. Za 2-3 dny proveďte konfokální mikroskopii epidermis na abaxiální straně listu (viz metoda 4A). Metoda ID Určení optimální sekvence PCR primeru na základě úseku DNA z Arabidoysis thaliana pomocí programu OLIGO 7 Praktické seznámení se základními pojmy a menu na počítači Aktuální oligo. Typy příměrů (forward, reverse). Volná energie. Dimer versus duplex. Interní stabilita. Vlásenky. Účinnost primeru. Terminálni stabilita. Teplota tání Tm. Vložení sekvence úseku DNA z Arabidopsis thaliana do databáze. Specifikace parametrů navrhované dvojice primeru, výběr optimální dvojice pro PCR amplifikaci studovaného úseku DNA. Finální výstup v tištěné podobě přiložte k protokolu. Syntéza PCR primeru na syntetizátoru Expedite 8909 Vložení sekvence primeru do databáze. Výtisk Volba parametrů syntézy (ON vs. OFF, rozsah syntézy), volba vhodné kolony, vlastní syntéza. Sledování účinnosti jednotlivých kroků syntézy (výtisk histogramu přiložte k protokolu). Odštěpení produktu z kolonky amoniolýzou. Tepelná deprotekce. Vakuové sušení v koncentračním systému Speedvac. Purifikace primeru: Odsolení gelovou filtrací na molekulovém sítu Odstranění nízkomolekulárních nečistot se provádí etanolovou precipitací nebo gelovou filtrací na kolonce Sephadexu G-25. Pokud je pro některé aplikace nutné odstranit kratší nedosyntetizované řetězce (např. pro antisense hybridizace), používá se purifikace na OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge). Nej účinnějším, ale finančně nejnáročnějším způsobem čištění je HPLC. Odsolení na CENTRI-SPIN 10 kolonce (Princeton Separations. Inc.). Vysušený vzorek primeru rozpustíme v 50 ul deionizované vody. Krátce necháme stát, protřepeme pnp. asi na minutu zahřejeme na 65 °C a nakonec krátce zcentrifugujeme. Hydratace kolonky CENTRI-SPIN 10 Sklepat suchý gel do spodní části kolonky, otevřít horní zátku a nanést 650 ul deionizované vody, zavřít a asi 5 s třepat na vortexu. Poklepáním se ještě zbavit posledních bublin. Poté nejméně 30 min nechat při pokojové teplotě probíhat hydrataci Sephadexu. Otevřít horní i spodní zátku kolonky a tuto vložit do připravené mikrozkumavky bez víčka (wash-tube). Centrifugovat 2 min při 750g (odpovídá 2700 otáčkám na centrifuze Eppendorf 5415C). Po skončení centrifugace je v mikrozkumavce voda, tj. odpad. Osušíme poslední kapky na kolonce. Taje nyní připravena k vlastní aplikaci vzorku, která by měla proběhnout během několika minut po skončení hydratace. 8 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Vlastní odsolení vzorku Kolonku vložte do mikrozkumavky s víčkem, víčko označte číslem skupiny (sample-tube) a opatrně do centra gelu po kapkách naneste automatickou pipetou předem 50ui připraveného vzorku. Následuje centrifugace 2 min při 75Og (2700 otáčkách). Po skončení centrifugace přidejte k odsolenému primeru v mikrozkumavce 950 ui deionizované vody, protřepte. Ve stojánku je připravena jedna mikrozkumavka označená na víčku UV (pro měření výtěžku) obsahující .......ui vody a jedna prázdná označená QC (pro chromatografickou kontrolu kvality). Do UV mikrozkumavky přidejte ...... ui odsoleného primeru na měření absorbance a do QC mikrozkumavky napipetujte 50 ui odsoleného primeru. Určení výtěžku. Stanovení absorbance zředěného vzorku měřením při 260 nm (spektrofotometr HELIOS). Definice jednotky OD. Výpočet výtěžku syntézy v jednotkách OD a převody do jiných jednotek. Vypočtěte, v jakém objemu vody je třeba rozpustit výtěžek, abyste dostali zásobní roztok o koncentraci 500 pM. Výtisk protokolu o syntéze s doplněným výtěžkem surového a odsoleného produktu přiložte k protokolu ze cvičení. Kontrola kvality. Chromatografie na ionexovém perfúzním sorbentu Poros HQ 10 (Applied Biosystems). Stručné seznámení s výhodami perfúzní chromatografie na přístroji BioCAD 700E (Applied Biosystems). Výběr vhodné kolony a vhodné analytické metody. Manuální nástřik 20 ui surového a odsoleného PCR primeru. Porovnání chromatogramů. Výtisk obou chromatogramů ve zvoleném modu (Tile, Overlay) přiložte k protokolu. Úkoly Doplňte následující protokol - pouze jeden pro dvojici PROTOKOL Číslo skupiny: Jména: Datum: Úloha: SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ Cíl: Seznámit se se současnými možnostmi při automatické syntéze oligonukleotidů, s dostupnými modifikacemi a aplikacemi. Porozumět základním zásadám pro navrhování PCR primeru. Pochopit základní princip syntézy oligonukleotidů a umět se zorientovat v jednotkách, ve kterých se vyjadřuje výtěžek. Umět vysvětlit základní rozdíl v čistotě produktu po jednotlivých typech purifikací. Návrh sekvence primeru Přiložte výstup ze software OLIGO 7, primery označte číslem skupiny, stručně zhodnoťte kvalitu nalezených primeru. 9 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Syntéza Přiložte histogram ze syntézy a protokol ze syntézy s doplněným výtěžkem vyjádřeným v jednotkách OD, Lig a v jednotce molární koncentrace. Uveďte výpočet objemu nutného pro přípravu zásobního roztoku primeru o koncentraci 500 uM. Odsolení Přiložte výstup z chromatografu obsahující chromatogramy surového a odsoleného vzorku. Jednou větou zhodnoťte, zdaje pozorovatelný rozdíl a vysvětlete. Rozšiřující literatura dostupná v Centrální laboratoři Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987. Aktuální verze „OLIGO", Primer Analysis Software. User Manual. Version 7, MBI, 2008. PCR Primer, A Laboratory Manual. Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 2003. 10 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 2 IZOLACE ROSTLINNÉ DNA, PCR, PRÁCE S DATABÁZEMI A NÁSTROJI PRO ZPRACOVÁNÍ MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÝCH INFORMACÍ Úvod Jednou z metod studia genomu je amplifikace krátkých úseků DNA pomocí PCR. V laboratoři si osvojíte rychlou metodu izolace DNA z rostlinného materiálu a založíte několik PCR reakcí. Amplifikovat budeme oblast inzerce cizí DNA (transpozonu En-1, dSpm a T-DNA) v genech AHP4, ARR4 a ARR21. Také se seznámíte s genomickými databázemi a užitečnými nástroji pro genomiku. Časový harmonogram 8:30 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 3. Zahaj ení barvení 8:45 IZOLACE DNA (Markéta Žďárská), laboratoř 334 10:00 DATABÁZE (Jan Skalák) 12:00 OBĚD 13:00 ZALOŽENÍ PCR (Markéta Žďárská), laboratoř 334 14:00 DATABÁZE-dokončení (Jan Skalák) 15:30 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hej átko), laboratoř 334 4. Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C 15:45 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 4. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 2. DNE Přehled Úvod k praktické části • Úvod do metodologie praktika o obecné zásady práce s DNA a sterilními roztoky o schéma experimentu o navržení postupu pro identifikaci inzerčního mutanta a zjištění jestli se jedná o homo-nebo heterozygotní stav, vlastní provedení 11 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Praktická část 1. Izolace DNA 2. Založení PCR Metoda 2A Odbarvování preparátů pro analýzu genové exprese pomocí transkripční fuze 1. Proveďte výměnu 80% etanolu a umístěte semenáčky na 4°C, kde je ponecháte do 4. dne (čtvrtek). Metoda 2B Rychlá izolace DNA pro PCR 1. Homogenizovat jeden střední vymražený list vychlazenou skleněnou tyčinkou v l,5ml zkumavce (eppendorfka) ve stojánku. 2. Přidat 400 ul extrakčního pufru, vortexovat 5 s a nechat stát při laboratorní teplotě 10 min. 3. Centrifugovat při 14000 otáčkách 10 min, 4°C. 4. Přenést 300 jíl supernatantu do nové l,5ml zkumavky a přidat 300 \ú izopropanolu, 4-6 krát překlopit. Nechat stát 5 min při laboratorní teplotě. 5. Centrifugovat 10 min, 4°C. Odstranit supernatant, DNA vysrážená izopropanolem bude v peletu. 6. Přidat 500 ul 70% etanolu. Centrifugovat při 14000 otáčkách 2 min. Odstranit etanol. Nechat vysušit (SpeeďVac, cca 5-10 min; na stole). 7. Pelet rozpustit ve 100 ul sterilní ddfhO. Genomovou DNA uchovávat na ledu nebo v lednici. Extrakční pufr Tris/HCl (200mM, pH7.5) NaCl (250mM) EDTA (25mM) SDS (0.5%) Založení PCR Do 0.2 ml zkumavek pro PCR napipetovat postupně vodu, pufr, dNTP, templát, primery a Taq polymerázu podle schématu: PCR směs: lOxpufr dNTP priml prim2 Taqpol. templ. DNA H20 celk. 50 ul 5ul 4ul lul lul 2ul 5ul 32 ul 12 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM primery AHP4 spec: primery ARR21 spec. primery ARR4 spec: primer transpozon A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Sim612, Sim799 - 212 bp 16kon, 16new- 340 bp ARR4N, ARR4S - 137 bp 8130, Sim 799- 250 bp 8130, 16new- 390 bp dli, ARR4N- 195 bp Navrhněte vhodnou kombinaci primerů a to tak, abyste byli pomocí výsledků PCR reakce schopni identifikovat inerčního mutanta ve vašem genu a zjistit, zda se jedná o jedince homozygotního nebo heterozygotního pro danou inzerční alelu. Kombinace primerů pro jednotlivé typy templátů (viz také schéma na následující straně): primery templátová DNA AHP4: la ..................... ................... 2a ..................... ................... 3a ..................... ................... 4a ..................... ................... ARR21: lb 2b 3b 4b ARR4: lc 2c 3c 4c Na základě přiložených výsledků analýzy použitých primerů pomocí programu Oligo navrhněte vhodné podmínky PCR pro dané reakce: Cvklus:94°C .... s 30 cyklů: 94°C ... s 58°C ... s 72°C ... s 72°C ... min 4°C oo 13 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY ARR4 AHP4 ARR21 dli dSpm r ARR4G B130 H En-l SIM799 B130t ■ dSpm lSkúii 1 6ncw Metoda 2C Stručná charakteristika: Vyhledání genové, proteinové sekvence genu zájmu. Seznámení se s dohledáváním důležitých informací vztahujících se ke genu zájmu. Určení podobných genů a následná fylogenetická analýza vybraných genů. Vyhledávání promotorových oblastí a analýza vazebných míst pro transkripční faktory. Analýza a zpracování obrazových dat. Databáze: NCBI - Databáze a nástroje shromažďující genomické a biomedicínské informace http: //www .nebi .nim .nih. gov/ EMBL-EBI - Databáze a nástroje shromažďující genomické a biomedicínské informace https://www.ebi.ac.uk/ 14 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY TAIR - Databáze shromažďující informace pro práci s Arabidopsis thaliana. www.arabidopsis.org Genevestigator - Databáze shromažďující informace o expresi genů u rostlin a v biomedicínské praxi https://genevestigator.com/gv/index.isp Nástroje: Omic tools - Databáze bioinformatických nástrojů pro genomiku https://omictools.com/genomics2-category Plant Image Analysis - Databáze nástrojů pro zobrazovací analýzu rostlin http://plant-image-analysis.org/ Alibaba2 (Transfac) - nástroj pro vyhledávání vazebných míst v promotorové oblasti genů http://www.gene-regulation.com/login Image J - Nástroj s širokým využitím pro manuální a zautomatizovanou analýza a zpracování obrazových dat na pozadí Java https: //imagei .nih. gov/ij /index.html Úkoly (příklad): 1. Vyhledejte jeden bakteriální a jeden rostlinný gen Glu-6-P izomerázy v databáze Genbank 2. Vyhledejte geny cheY a cheA u E. coli 3. Určete nejbližší homolog cheY(ií. coli) u Arabidopsis pomocí algoritmů BLAST a FASTA. 4. Najděte tři různé regulátory odezvy nebo histidin kinázy u Arabidopsis. 5. Určete u libovolného genu v úkolu 4 polohu v genomu Arabidopsis (chromosom, polohu v publikované sekvenci daného chromosomu). 6. Vyberte si jeden gen z úkolu 4 a určete oblast 1000 bazí v oblasti promotoru genu. Ukončete sekvenci na ATG Analyzujte na přítomnost vazebních míst transkripčních faktorů pomocí hledání v databázi TRANSFAC. 7. Srovnejte libovolné sekvence z Arabidopsis s homologií větší než 30% a menší než 100% pomocí algoritmu CLUSTAL Omega. 8. Vyhledejte nejméně jednu EST sekvenci Glu-6-P izomerázy (hledání homologie nebo podle klíčového slova). 15 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Izolace DNA a PCR Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr3: 3 Uveďte zejména, zda jste identifikovali inzerčního mutanta a zda se jedná o homozygota nebo o heterozygota pro danou inzerční alelu a proč. 16 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 3 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTU V GELU, qPCR METODA Úvod PCR produkty rozdělíme pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a představíme si metodu kvantitativní real-time PCR (qPCR), což je moderní technika molekulární biologie umožňující rychlou, citlivou a spolehlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA. v Časový harmonogram 9:00 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová, 334) Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C 9:15 TEORETICKÝ ÚVOD KE qPCR (Markéta Žďárská), laboratoř 334 9:30 PŘÍPRAVA AGARÓZOVÉHO GELU, NAPIPETOVÁNÍ VZORKŮ, ELEKTROFORÉZA (skupina 1-3, laboratoř 333) / PŘÍPRAVA KALIBRAČNÍ PŘÍMKY A VZORKŮ PRO ANALÝZU POMOCÍ qPCR (skupina 4-6, laboratoř 334, 329) (Markéta Žďárská) 10:45 PŘÍPRAVA AGARÓZOVÉHO GELU, NAPIPETOVÁNÍ VZORKŮ, ELEKTROFORÉZA (skupina 4-6, laboratoř 333) / PŘÍPRAVA KALIBRAČNÍ PŘÍMKY A VZORKŮ PRO ANALÝZU POMOCÍ qPCR (skupina 1-3, laboratoř 334, 329) (Markéta Žďárská) 12:00 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTŮ V AGARÓZOVÉM GELU (laboratoř 333) (Markéta Žďárská) 12:30 OBĚD 14:00 qPCR vyhodnocení (Markéta Žďárská) 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 3. DNE Přehled metod 1. Elektroforéza DNA v agarózovém gelu 2. Detekce fragmentů v UV světle 3. qPCR 17 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 3A Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce. 1. Připravit 400 ml 1,5% agarózy v lx TBE pufru a rozvařit. Po rozpuštění agarózy přidat MidoriGreen, která bude sloužit k vizualizaci DNA. 2. Připravit formu pro gel, vsadit hřeben a nalít do formy vrstvu tekuté agarózy 5-8 mm. Nechat ztuhnout. 3. Formu s gelem vložit do elektroforézové vany, zalít pufrem a vyjmout hřeben. 4. Napipetovat délkový a hmotnostní standard a vzorky: • délkový a hmotnostní standard (2-Log): 1 pg • vzorky: 10 pl PCR + 2 pl 6x konc nanášecího pufru 5. Spustit elektroforézu při 80 V po dobu 60 min. Pozorovat proužky DNA v procházejícím UV světle a výsledek elektroforézy dokumentovat. Mass (ng) KHoIhsbs Délkový a hmotnostní standard: 2-Log DNA ladder (0,1 - 10,0 kb; 1 pg) 18 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 3B Příprava kalibrační přímky pro qPCR a analýza genové exprese ARR5 Real-time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) přímo během reakce (tzv. „v reálném čase") pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Její výhodou oproti konvenční PCR je možnost přesného stanovení výchozícho počtu kopií cílové templátové sekvence DNA, čili schopnost kvantifikace. Real-time PCR se provádí s pomocí přístrojů zvaných cyklery, které umožňují jak provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu PCR. Real-time PCR kvantifikace Používané matematické modely pracují s hodnotou zvanou Ct („threshold cycle"), která se rovná cyklu, kdy amplifikační křivka překročí zmíněný fluorescenční práh umístěný do počátku exponenciální fáze reakce. Absolutní kvantifikace, která se používá např. při detekci specifických mikroorganismů, přímo určuje výchozí počet kopií cílových molekul. Je založena na zjištění, že existuje lineární vztah mezi logaritmem výchozího počtu kopií templátové DNA a Ct příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci, získáme kalibační přímku („standard curve"), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku. Relativní kvantifikace, která se používá ke stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje sestrojení kalibrační přímky. Porovnává se relativní změna genové exprese {relativní expresní poměr) v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku, kterým může být např. mRNA neovlivněných buněk a pod. Ct amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti Ct tzv. housekeeping genu. Při kvantifikaci mRNA {měření genové exprese) se před vlastní PCR provádí reverzní transkripce -přepis mRNA do tzv. cDNA {RT), která je následně amplifikována pomocí PCR {RTqPCR). A g c OJ (N0)i-(N0)a-(N„>s- 103 101 / B KALIBRAČNÍ PŘÍMKA luoresc "o Z "standard curve" nzita 1 3 J2 N0 = výchoz i koncentrace S c fluorescenční ~j práh *5 Ct = "threshold cycle" /' /' / I / I I / I J 2 i i i I I ' ! (Ct)i (Ct)2 (Ct)3 počet cyklů (ct)1 (Ct)2 (ct)3 ct 19 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY 1. Připravte master mix (MM) pro kalibrační přímku genu QlO/ARRx a k MM vždy přidejte 4 pl cDNA nebo neg. kontrolu. Celkový objem qPCR mixu pro 1 reakci je 20 ul, která obsahuje 16 ul MM a 4 ul cDNA nebo 4 pl neg. kontroly. Pro kalibrační přímku si připravte cDNA s ředěním lx, lOx, lOOx, lOOOx a lOOOOx. Každou reakci připravte pro danou cDNA 2x ~ 2 technická opakování. MM pro 1 reakci/16 ul (na 1 vzorek cDNA/4 ul) a. 10 ul Fast SYBR Green Master b. 0.6 ul primer F c. 0.6 ul primer R d. 4.8plH20 Připravte MM pro .... reakcí (.... vzorků cDNA), a.....u.1 Fast SYBR Green Master b.....u.1 primer F c.....u.1 primer R d.....ul H20 2. Připravte master mix (MM) pro analýzu exprese genu QlO/ARRx v daných dvou vzorcích a k MM vždy přidejte 4 ul cDNA nebo neg. kontrolu. Celkový objem qPCR mixu pro 1 reakci je 20 ul, která obsahuje 16 ul MM a 4 u.1 cDNA nebo 4 u.1 neg. kontroly. Každou reakci připravte pro danou cDNA 3x ~ 3 technická opakování. MM pro 1 reakci/16 ul (na 1 vzorek cDNA/4 u.1) a. 10 u.1 Fast SYBR Green Master b. 0.6 pl primer F c. 0.6 pl primer R d. 4.8plH20 Připravte MM pro .... reakcí (.... vzorků cDNA), a.....pl Fast SYBR Green Master b.....pl primer F c.....pl primer R d.....pl H20 3. qPCR analýza pomocí přístroje QIAGEN Rotor-Gene® Q + vyhodnocení Cyklus pro QlO/ARRx: 95°C 7 min .... cyklů: 95°C 15 s 56°C 30 s 72°C 20 s 72°C lmin 20 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: qPCR Jméno: Datum: Popis výsledků: Závěr: 21 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 4 BUNĚČNÉ LOKALIZACE PROTEINŮ Úvod Schopnost interagovat s dalšími proteiny je jednou ze základních charakteristik bílkovin jakožto základního kamene živých organismů. Protein-proteinová interakce je nutným předpokladem i pro přenos informace v signálních drahách. Informace se obvykle předává v podobě fosfátové skupiny mezi kinázou a jejím proteinovým substrátem, který je specificky rozpoznáván, anebo je prostřednictvím protein-proteinové interakce přímo ovlivňována aktivita interakčního partnera. Jednou z prvních otázek, které si klademe při funkční analýze genů signálních drah, je ta, se kterými dalšími signálními elementy studovaný protein interaguje. Další důležitou otázkou je, ve kterém buněčném kompartmentu je protein lokalizován, případně ve kterém buněčném kompartmentu spolu dva proteiny interagují. S použitím transientní exprese proteinů po infiltraci listů tabáku Nicotiana benthamiana suspenzí Agrobacterium tumefaciens a s pomocí skenovací laserové konfokální mikroskopie, můžeme tyto otázky zodpovědět. v Časový harmonogram 8:30 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE I, skupiny 1-3 (Markéta Šámalová), laboratoř 334 / ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE I, skupiny 4-6 (Jan Hejátko) 11:30 OBĚD 12:30 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE II, skupiny 4-6 (Markéta Šámalová), laboratoř 334 / ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE II, skupiny 1-3 (Jan Hejátko) 15:30 AUTOMATICKÁ MIKROSKOPIE (Jan Hejátko) 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 4. DNE Přehled metod 22 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Rastrovací konfokální mikroskopie (Confocal laser-scanning microscopy, CLSM) Jedná se mikroskopickou metodu umožňující snímat fluorescenční signál s velmi vysokým rozlišením. Jako bodového zdroje excitačního světla používáme lasery o různé vlnové délce. Laserový paprsek prochází konfokální clonkou a prostřednictvím objektivu je fokusován do malého bodu na preparátu, kde dojde k excitaci fluorescenčních barviček, nebo proteinů. Emitovaná fluorescence prochází zpět objektivem a skrze další konfokální clonku (pinhole) na fotonásobič, kde je světelný signál převeden na elektrické impulsy. Konfokální clonka zajišťuje, že se na detektor dostane pouze světlo z excitovaného bodu v rovině ostrosti použitého objektivu. Světlo přicházející z oblastí nad a pod rovinou ostrosti je clonkou odfiltrováno. Posunu ohniska skrz celé zorné pole objektivu je dosaženo plynulým pohybem zrcátka skenovacího zařízení. Protože rychlost jeho pohybuje mnohem nižší než rychlost světla, jsme schopni pomocí softwaru zrekonstruovat obraz s vysokým rozlišením a zobrazit ho na monitoru počítače. Principe of confocal illuminating aperture point source (laser) focal plane detector confocal detector aperture (PINHOLE) ^ dichroic mirror objective lens specimen 23 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 4A Buněčné lokalizace proteinů 1. Připravte si 100 u.1 pipetu, destilovanou vodu, krycí a podložní sklíčka, která popište. 2. Na střed podložního sklíčka kápnětelOO u.1 vody. 3. Z listu tabáku infiltrovaného v pondělí vystřihněte přibližně čtvercový tvar o ploše 1-2 cm2 a umístěte ho na kapku tak, aby spodní strana listu směřovala vzhůru. 4. Na spodní stranu listu naneste 100 u.1 kapku vody, přiklopte krycím sklíčkem. 5. Jemným poklepáním zajistíte dosednutí krycího sklíčka a odstraníte vzduchové bubliny. 6. Zpevněte sklíčka k sobě pomocí lepící pásky. 7. S připravenými preparáty se přesuňte ke konfokálnímu mikroskopu. 8. Pomocí rastrovací konfokální mikroskopie sledujte fluorescenční signál a jeho lokalizaci uvnitř buněk. 9. Vyhodnoťte výsledky pozorování a vypracujte protokol, ve kterém zpracujte všechny body uvedené v šabloně. 24 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Analýza buněčné lokalizace pomocí fluorescenčních reportérů Jméno: (uveďte rovněž číslo své skupiny): Datum: Cíl: Úloha: Jaké buněčné kompartmenty (zelené and červené) vidíte na obrázku A-D? Který z 2A konstruktů použila vaše skupina? (STnRFP-2A-GFPHdel, YFP-2A-GFPhdel, ii1sRFP-2A-GFPhdel) A B C \ Postup: Uveďte stručný popis postupu při infiltraci tabákových listů (viz. Metoda 1C). Proč je součástí infiltračního média acetosyringon? Závěr: Vyhodnoťte interakce a lokalizace proteinů, které vaše skupina zkoumala a shrňte výsledky kolegů z dalších dvou skupin. 25 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 4B Příprava preparátů pro automatickou mikroskopii Proveďte projasnění odbarvených semenáčků podle následujícího protokolu: 1) Opatrně odpipetujte 80% etanol a přidejte 1 ml 0,25M HC1 / 20% MetOH, inkubace 15min při 53 °C4. Roztok opatrně odsát pipetou. 2) 1 ml 7% NaOH / 60% EtOH, inkubace 15 min při rt5. Roztok opatrně odsát pipetou. 3) 1 ml 40% EtOH, 10 min, rt. 4) Přidejte 1 ml H20 = 20% EtOH, 10 min, rt. Roztok odsát. 5) 1 ml 10% EtOH, 10 min, rt. 6) +1 ml 50% glycerolu = 5% EtOH / 25% glycerol, 15-30min, rt (on, 4 °C). Roztok odsát. 7) 1 ml 50% glycerol. Metoda 4C Automatická mikroskopie 1) Vložte preparáty do automatického mikroskopu a nechte snímat pře noc. 26 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 5 8:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko) / DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 5. Vyhodnocení výsledků automatické mikroskopie 10:00 kolokvium (A2/2.11) 27