ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD O D O □ O _n " " O D O D O
MASARYKOVA UNIVERZITA
ODODOuwuODODO □ ODODODODODOD ODODODODODODO
dodododododod ododododododo
□ odododododod ododododododo
□ odododododod ododododododo
□ odododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo
□ odododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo
□ odododododod ododododododo
BHP   ' T™^% I ministerstvo školství, OP Vzdělávání ~%?LJrJ?
ododododododo dodododododod
ododododododo INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
dodododododod
ODODOaononono
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
Design sekvence PCR primerů
Hana Konečná
CEITEC - MU Centrální laboratoř - Proteomika Přírodovědecká fakulta NCBR
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
mUf     o cd
^^™>^^™ ^S^J I MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání
EVROPSKÁ UNIE 9^^^ ■ mládeže a tělovýchovy pro konkunmcMchopnort Míta**"
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD O D O D O Z. C-'7 O D O D O
D OD<^]Síh V* O °
ODODOuv^uODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
I [M| *  MASARYKOVA UNIVERZITA
PCR primery
definice aplikace modifikace syntéza
design sekvence zásady navrhování software OLIGO 7 praktická ukázka
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, mládeže a tělovýchovy
evropská unie H
INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
OP Vzdělávání pra konkurenceschopnost
ODODODODODODO DODODODODODOD
ÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍ°Í     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
oligonukleotid
krátká jednořetězcová struktura DNA nebo RNA (event. PNA, LNA. hydroxyl na obou koncích (normálně na 5'- konci fosfát)
oligonukleotid
syntetický oligonukleotid
PCR primer
orientace! polymeráza!
)H
5' end Hj
DODODODODOD O D^
ODODODODODODO
DODODODODODOD
ODODODODODODO
DODODODODODOD
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
	g	1	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
Aplikace syntetických oligonukleotidů
• primery pro syntézu komplementární DNA
PCR, Real-Time PC R
• syntéza genů a rekombinantní proteiny
• hybridizační sondy pro klonování
• místně cílená mutageneza
• sekvenování a genetické profilování
• diagnostika-testy a biosensory
• gene arrays
• blokace genové exprese antisense oligo
• potenciální léčiva a DNA vakcíny
• NMR studia interakcí DNA-protein
• strukturální rentgenová analýza NA
ODODODODODODO DODODODODODOD
ÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍ°Í     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
Modifikace
• degenerace
• konce řetězce
• báze
• fosfát
• cukr
• PNA
ODODODODODODO
□ ODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD
ODODODODODODO _
onononononono
Modifikace na 5'- konci
postsyntetické modifikace
sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO □ ODODODODODOD
5'
fosforylace
aminoskupina
thioskupina
digoxigenin
biotin
enzymy
psoralen
akridin
cholesterol
fluoresc. barviva
zhášedla
2,4-dinitrofenyl
TBR-chelát
spacer
větvení
blokáda
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
Modifikace na 3'- konci
y
derivatizovaná matrice fosfát
thioskupina —* aminoskupina spacer akridin —► biotin —► fluoresc.barviva —- zhášedla cholesterol 2,4-dinitrofenyl
□ OdodododOdOd odododooododo
□ ODODODOnonon
ODODODODODOnO
□ODODODOnonon
ODODODODODODO □ ODODODODODOD
IIIIIÍIÍÍIÍII     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
DODODODODODOD ODODODODODODO
antisense oligonukleotid
• oligonukleotid nebo analog
• komplementární k segmentu RNA nebo DNA
• vazbou inhibuje jejich normální funkci
Antigene (triplex)
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
Ribozyme
RNA
s katalytickou aktivitou
Antisense
Sense/Aptamer
ododododododo
□ odododododod
illlilllilll!     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODOaOn ododododododo
TGľapGUtika —* nedegradována nukleázami!
modifikace fosfodiesterové vazby
O = P ŕ S"x 0 = P^CH
i v_y i
o. O
phosphorothioate        methylphosphonate phosphoramidate
• "CH2 "O
CH2 H3C-N 0 = P-BHľ
l 3     I 1 3
0 0
3'-thioformacetal     methylene(methyliminio) boranophosphate
odododooododo
□ odododododod ododododododo
□ odododododod
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
TIDES: Oligonucleotide and Peptide Therapeutics
• Messenger RNA Therapeutics
• CRISPR-Cas9 and Applications of Genome Editing
• Risk-based Approaches to CMC Development of Therapeutics Oligonucleotides
• Opportunities for Extending to Larger Disease Populations
• Stereochemical Control of Antisense Oligonucleotides Enhances Target Efficacy
* Mechanisms of Action and Quantification of Biodistribution of Oligonucleotides
* Alternative Manufacturing Technologies to Reduce Cost of Goods in Oligonucleotide Manufacturing: Application of Enzymatic Manufacturing
* Late Stage Drug Product Development and Drug Product Manufacturing
* Nonclinical Case Studies in Oligonucleotide Development
* Regulatory Authority Expectations
DODODODODODOD
ODODODODODODO □ ODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
DODODODODODOD ODODODODODODO
Degenerované oligonukleotidy
kod baze
symbol AA nukleotidy
M
				
omfno acid	amino ocid symbol	nucleotide sequence (with degeneracy)	complement (for designing reverse primers)	
methionine		AJG	T AC	
tryptophan	w	JGG	ACC	
cysteine	c	JGY	ACk	
aspartic acfd		GAY	ctr	
glutamic acid	e	gar	CJY	
phenylalanine	F	tty	AA&	
histidine	H	CAY^	GJk	
lysine	K C	*AAft^)	TTY	
asparaqine	N		TTf>	
qlutamme	q	car	GTY	
tyrosfne	v	tav	atr	
isoleucfne	r	ATM	TAb	
Alanine	a	gcn	c6n	
glycine	G	GGN	ccm	
prolme	p	ccn	ggn	
threonine	t	acn	ton	
valine	V	gtn	can	
leucine	l	y~n\i	ran	
orginfne	r	aagn	kcn	
serfne	s	wsn	w5n	
uuuuuuuuuuuuu
w
K
V
H
B
N
A or C (A or (j)
zahrnuje
A or T
C or G
C or T
G or T
A or C or G
A or C or T
A or G or T
C or G or T
G or A or T or C
G or A or T or C
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
Degenerované oligonukleotidy
CODEHOP
Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers
HYDEN
HighlY DEgeNerate primers
2-deoxyinosin
□ ODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
M	A or C
R	A or G
W	A or T
S	C or G
Y	C or T
K	G or T
V	A or C or G
H	A or C or T
D	A or G or T
B	C or G or T
N	G or A or T or C
X	G or A or T or C
o	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O		
□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□		
o	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O	□	O		
□ o	O □	□ o	o □	□ o	O □	□ o	O □	□ O	O □	□ o	O □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	O	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
n	n	o	n	n	n	n	n	n	n	n	n	n		
Degenerované oligonukleotidy
Příklady:
ACG TAC G TA CGT ACG TAC nedegenerovaný
ACG TAM GTA CGT ACG TAC M = A/C
ACG TAC GTA CDT ACG TAC D = A/G/T
ACG TAC GTA CGT ACG NAC N = A/C/G/T
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
Real-Time PCR
• 2x značená sonda
• REPORTER
• QUENCHER
nOHWARD PPIMĽP.
ncvcpic Pllľ/ĽP
2, Strand displacement: When the probe is intact, the reporter dye emission is quenched.
r i a1
5_9,
ľ ľ
□ ODODODOnonon odododooododo
□ ODODODOnonon
ODODODODODODO
□ odododododod
3, Cleavage: During each extension cycle, the DNA polymerase cleaves the reporter dye from the probe.
r-a-
■■-r
-*- B'
4, Polymerization completed: Once separated from the quencher, the reporter dye emits its characteristic fluorescence.
ľ
B'
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIiIiIiIiIiI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
Peptidonukleová kyselina pna
terminal
• nenabitá molekula I
• vazba k DNA/RNA
N-(2-aminoethyl)-glycin
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
Repeat Unit
C-terminal
DNA 3'-end
ODODODODODODO DODODODODODOD		
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□ O d O d O
LNA
Locked Nucleic Acid
2'-0, 4'-C methylenový můstek potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjimečná biostabilita
ODODODODODODO DODODODODODOD
ÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍ°Í     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
OLIGONUKLEOTIDY
organická syntéza
na pevné fázi žádný enzym!
od 3'- konce k 5'- konci
bezvodé prostředí
EXPEDITE 8909
o □ o □ o
□ o □ o □ o □ o □ o
□ o □ o □ o □ o □ o
□ o o o o
□ o o □
□ o o □
□ o
O o
□ o □ o □ o o □ o □ o □
□ o □ o □ o o □ o □ o □
□ o □ o □ o o o o □ o □
OnODODODODODO
MASARYKOVA UNIVERZITA
www.muni.cz
Syntéza oligonukleotidu
B,
O
II
P-0-^j-O-p.
o-      N o
Cleavage/Deprotection
- OH
1
DMT- O
OR
Step 2. Coupling
O
syntéza na pevné fázi od 3'-konce k 5'-konci bezvodé prostředí
T— O —^ - O
B,
HO-
- o -
Stepi. Deblocking
Activation
DMT- O
-\ - O — p -NíiPr), Ofl
+ Tetrazole
ononoDononono
□ ODODODODODOn
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
F V V
VYTEZEK
1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 Yield o.500
0.400 0.300 0.200 0.100 0.000
It
□
□
o-
□
-Q
□
n
Efficiency
□ 0.995
■ 0.990
■ 0.980
0    10  20  30 40  50  60  70  80  90 100 Oligonucleotide Length
PAGE
DODODODODODOD ODODODODODODO
ezai0pjp|9|9 BA0|99 •
OldH •
e>juo|0>i incIsjimiju X8pei|d8s • OD e 30V>1ldiand
ODODODODODODO
zD-mnui-MMM VlIZ^BAINfl VAO>IAWSVW     i ISISISIS1111
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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□ ODODODODODOD ODODODODODODO
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
□ ODODODODODOD
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9!jej6ojewojip luznjjsd
ODODODODODODO
ODODODODODODO
zD-mnui-MMM VllZ*J3AINn VAO>IAWSVW    IIIIIIIIIIIII
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
Jaký typ purifikace vybrat?
• aplikace oligo
• délka oligo
• modifikace oligo
• výtěžek oligo
PCR nebo sekvenování standardní odsolení
Klonování. Mutageneza . Gel shift *       HPLC . PAG E
Modifikované oligonukleotidy
* affinity electrophoresis for protein-DNAor protein-RNA interactions
22
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
PCR primery
Methods in Enzymology 529 (2013) Laboratory Methods in Enzymology: DNA Explanatory Chapter: PCR Primer Design
httpy/^w.genomecompiler.com/tips-for-efficient-primer-^^
D O D ODO
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISISI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
DESIGN OLIGONUKLEOTIDU
• manuální
• počítačový
www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/PCR_
Primer_and_Oligo_Design_/index.html
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1526718/pdf/1746-4811 -2-4.pdf
https://academiciournals.org/iournal/AJB/article-full-text-pdf/D84CFC59144
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primem
• vysoce specifické - zejména 3'konec
• netvoří dimery a vlásenky
• stabilní duplexy s aktivní sekvencí
• nepříliš stabilní 3'-konec
• obvykle 18 - 25 nt
• 40% až 60% GC
www.genomecompiler.com/tips-for-efficient-primer-design/
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
(g)
OLIGO 6
PCR primery, hybridizační sondy sekvenační primery
OLIGO 7 (od roku 2008)
TaqMan sondy primery pro nested PCR molecular beacons siRNA
Oliqo 7 Power Point Presentation http://www.oligo.net/tutorials.html
ODODODODODODO DODODODODODOD
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□ ODODODODODOD ODODODODODODO
Terminologie PCR primem
forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna
pos:     350      tm: 57.1	
	
CCTGGCTíTGACTACTCA ►>■►►*■......►......►......►   ►   ►   ► i	hhhhhhthhth
	
TTAATGC CTG G CTGTGACTACTCAC E E E E EAAGGATGGTATTGAGC CTATGTG G G AAG A GAGAAAAACAAAC GGGGAGGACGATG G CTAATTACATTGAACAAACAiH: AíACACG AACTÍACC C	
AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTC11111GTTTGCCCCTCCTGCTACCGATTAATGTA;	tCTTGTTTGTC GTCTCTG CTTC ACTG G AG
	
	
LHPGCQY5   L   F   K   D   -G   IE   P   M   i   E   DE   KNKRGGRi ITL	N   K   Q   Q   R   R   5 DL
UPPER - FORWARD - LEFT 5'-►
+ 5'-- 3'-
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
■ 3'
■ 5'
5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
ODODODODODODO DODODODODODOD
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□ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
Terminologie
forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna
pos:
350
tm: 57.1
,Ittt,         , i 270 _	,,200,        .itt1?,,         100                             120 110	110           100 170
		
		
TTAATG C CTG G CTGTGACTACTCAC1	111IAAGGATGGTATTGAGCCTATCTG G GAAGATGACAAAAACAAAC GGGGmGGACGA GG CTAATTACATTGAmCAAAtACtACACAt CAACTCAt t C	
AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG CCCCTCCTGCTACC GATTAATGTAACTTGTTTGTC GTCTCTG CTTCACTG GAG		
H                   H                   H                   i                   H H	< ACTC G GATACAC CCTTCTACTC	
		
LHPGCQY5 L	FKDCIEPHWEDEKNKRGGRW ITL	NKQQRR5DL
UPPER - FORWARD - LEFT
5' » polymeráza
+ 5] ^=^=| 3'
- 3'-
5'
polymeráza * 5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
DODODODODODOO ODODODODODODO DODODODODODOO ODODODODODODO DODODODODODOO
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
	g	1	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
Nasedání PCR primem
pos:     350      tm: 57.1	
,,260,           ?73           , 2G0 _           ?33             300             l. 3             3?0 33Ü	l<3 ÖG3
	
	
TTAATGCCTGGCTGTGACTACTCACIUIIAAGGATGGTATTGAGC CTATGTG G GAAGA GAGAAAAACAAACG G G GAG GAC GATG GCTAATTACA   GAACAAAtAGtAGAGACGAAGTGAtt C	
AATTAC G G AC C G AC ACTG ATG AGTG AAAAATTC CTAC C ATAACTC G G ATAC AC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C G ATTAATGTAACTTGTTTGTC GTCTCTG CTTCACTG GAG	
.........ACTC G GATACAC CCTTCTACTC	
	
LMPGCDY5LFKDGIEPMÍEDEKNKRGGRW ITL	N   K   Q   Q   R   R   5   Q L
UPPER - FORWARD - LEFT
5'
+ 5'-- 3'-
3' 5'
5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
dooododododod ooododooododo □ ODODODOnonon
ODODODODODODO dodododododod
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
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o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
	g	1	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
5'CTTCTGCTCAATCTTTCTAC 3' FORWARD
+ C ' 1 ATGGÍTTCTG CTCAATCTTT CTAfjAACCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA 51 TGTCÄI     I I (j ILLkLLk I (j ÁI (ľATGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA 101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT 151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT 201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT 251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA 301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT 351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA 401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA 451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA 501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT 551 AAAAAAAAAA AAAAAATTfiT AAATrdTfiTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA 601 TCTTAGTTTAJ AAACTAGCTG ATATTCTTCAIAATCGACTGT TCTTATAAGT
651 aatcaaccaa'ttaocatcaa tcacaatam Fttgtaaacac TTCAATGAAA
701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT
751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC
801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA
851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT
901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG
951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT 1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC 1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA 1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA
3'
5' TGAAGA ATA TCA GCT AGT TT 3' REVERSE
ODODOnononono □ ODODOnononon ODODOnononono
DODODODOnOnOD
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
.BOO
File: Human 4E.seq
Sequence
=1
DNA Sequence				Selected Oligo	Position	Length	#	Feature	Location
Sequence Length:	LS6S nt	JJ B		Forward Primer	259	IS	1	source	-IE..1S5Ö-
Reading Frame:	+ 1	JJ	U	Reverse Primer	32S	13		CD5	1..651
Current Oligo Length:	21 nt		n	Upper Oligo	—	—			
Position:	356	JJ		Lower Oligo	294	22			
JJ) tm:	593°C	JJ		PGR Product	S7nt				
m
pos:
350
tm:
57.1
?G3            ?73            2SD            ?33            333            3.3            323            333 .343 .......i.........i.........i.........i.........i.........i.........i.........i.........i.........	3Í3          .3EÜ 373 .........i.........i........
	
	
TTAATittTiGCTiTGACTACTCACS ŕ f f f AAG G ATG GTATTGAG C CTATGTG G GAAGATGAGAAAAACAAAC G G G GAG GAC GATG G CTAATTACATI	"GAACAAACAfiCACAGACfiAACTGACCTC
AATTAC G G AC C G AC ACTG ATG AGTG AAAAATTC CTAC C ATAACTC G G ATAC AC C CTTCTACTC 1 1 1 1 IG 1 1 ULLLL ICC IGC IACCGAI lAAlUlAAU lU 11 ICilCCilClClCiCl 1CAC 3 G GAG	
	
	
LMPGCDYSLFKDGIEPMHEDEKNKRGGR* ITL	NKQQRR5DL
\
m
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
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o □ o □ c
□ ono: o □ o □ c
□ odo: o □ o □
Search for Primers & Probes
Search Options Subsearches
Search in: 5tf + Strand §j - Strand Search Mode: @ Select Verify
m Complex Substrate
© PCR Pri
mers
Compatible with the Q Forward Primer
O Reverse Primer
TaqMan Probes & PCR Pairs
Compatible with the      Upper Probe       Z Lower Probe
\ Molecular Beacons & PCR Pairs
Nested Primers
Sequencing Primers C Hybridization Probes
siRNA Probes
After successfull search show:   All Results
' Search
( Cancel ) (    Apply )
i Parameters ) { Ranges ) ( Defaults )
\J    U LJ    W    LJ W
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e
Search for Primers & Probes
Search Options Subsearches
Search method: Compatible Pairs
|| Eliminate Ambiguous Bases fj§ Duplex-free Oligonucleotides B Highly Specific Oligonucleotides (3'-end Stability) □ 5-end Stability _ siRNA Internal Stability S Oligonucleotides with CC Clamp 0 Oligonucleotides within Selected Tm Limits 0 Hairpin-free Oligonucleotides §3 Eliminate Mono- and Di-Nucleotide Repeats 0 Detect Sequence Repeats B Eliminate Frequent Oligonucleotides 0 Omit High Secondary Structure Regions in the Template B Check Primers/Probe Sequence Constraints 0 Restrict the Number of C Bases 3 Eliminate False Priming Oligonucleotides and _ Continue Above Search in Other File(s) _ Consensus Primers
^ Search 1
( Cancel ) (   Apply )
i Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults )
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
PCR
~1
filc: lutrľ.n 4Lscq
5
Optimal Annealing Temperature: 50.S °C (Max: 66.3 °Q
	Position and Length		Tm rq       GC N		P.E.#	Score
Product	S62		7S.9	29.6	n/a	697
Forward Primer	91S	22	56.9	45.5	471/47L	S40
Reverse Primer	L7S3	21	55.3	29.6	4S9 / 4S9	834
Upper Ol i go	979	24	56.5	33.3	479 / 479	9L7
Lower Oligo	L694	23	55.4	39. L	457 / 457	84 L
Product Tm - Reverse Primer Tm: 23.6 °C
Primers Tm difference: L6 °C
Comments:
	Concentration	
Forward Primer	200.0	nM
Reverse Primer	200.0	nM
Upper Oligo	200.0	nM
Lower Oligo	200.0	nM
Monovalent Cation	50.0	mM
Free Mg[2+|	0.7	niFV
Total Na[+] Equivalent: L55.S mM
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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O D
□ O D O
f
Selected Primers
file: BRCA2 gene.seq
AY436640:1543SF22	
5' C A ATA TA TA C C CTA CTC C C CTA 3'	
Length:	22-nier
Score:	802 points
5' Position:	15435
Tm/tm: 53.4	52.6 "C
AG/Ag (25 *Q: -30.5	-29.2 kcal/rnol
AS/As: -472.1	-449.5 cal/°K*mol
AH/Ah: -L7L.3	-163.2 kcal/rnol
3'AC:	-6.5 kcal/niol
Degeneracy:                             ^ J	
P.E.#:	(443/443)
1/E:	—nm ol /A2 G0
31. L Lig/AzGo	
AY436640:15917R20
5' CA C CTA C ATATTA C C C C A C A 3'		
Length:		20-mer
Score:		914 points
3' Position:		15917
	53.1	53.8 °C
AG/Ag (25 *C):	-28.6	-28.5 kcal/rnol
A5/As:	-430.5	-419.6 cal/°K*mol
AH/Ah:	-157.0	-153.6 kcal/mol
3'AC:		-6.9 kcal/mol
Degeneracy:		.___A
P.E.#:		Q77/47y
1/E:		fftfinm ol /A2 G0
31.0 Mg/A260		
Priming Efficiency PE Score
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
Sekundární struktury     • HAIRPIN intramolekulární
• DIMER intermolekulární
Hairpin
y ÖGGAAA^i I III
5' TATCTAGGACCTTA-
3' GGGaA^ II   I A 5" TATCTAGGACCTTA-^
Self-Dimer
8 bp
3 '   gggaaaattc c aggatc tat    51
I I I I    I I I I
51   t atc tag gac c tt aa a aggg 3'
4 bp
3' gggaaaattc c aggatctat 5' I i I I
5 1   t atc taggac c tt a a a aggg    3 ■
Dimer
forward printer 5'   TATC TAG GAC C TTAAA AGGG 3'
3' C ATGGAAAC G TAGGAGAC 51 reverse primer
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ododododododo dodododododod
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□ odododododod ododododododo
ododododododo
HAIRPIN intramolekulärni DIMER intermolekulärni
eoe	Current Oligo Duplexes	
File: 0RCA2 gene.seq		
Current Oligo ZL-mer [5042]
[Currents Oligo! - The most stable B'-dimer: £ of hydrogen bonds = 10: AC = -0.7 kcal/niol
5"  GAATTAGATAAArrCAAArrA 31
III   II   II III 3 r ATTAAACTTAAATAGATTAAG 5 r
[Current- Oligo! - The most stable E'-dinier: *or" hydrogen bonds = L0: AC = -7.3 kcal/mol; Tm = 2„t
5r TAATTTGAA-TTATCTAATTC 3'
I I I I I I I I I I
3"   C TTAATi: rATTTAAt] TTTAAT 5"
The most stable dimer overall: # of hydrogen bonds = L0: AC = -7.4 kcal/niol; Tm = 2.2DC
S'   GAATTAGArAAATTHAAATTA 3'
I I I I I I I I I I
3 '  ATTAAAC 77/YAATAt] ATTAAt] 5 1
Hairpin: loop ■ 5 nt; AC = -3.0 kcal/mol; Tm = 54.6 °C
5 1 GAATTAG-,
I I I I I A 3 r ATTAAACTTAAAT -
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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O ^ &    Reverse Primer False Priming Sites
Fil€TM13MP18
Reverse Primer M13MP18 6310R19 (positive strand) U Priming efficiency of the perfect match is 482 (above the threshold) ▼
Priming efficiency. 482 (above the threshold)
I   5'(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
3  (6328) (6313)5
Priming
5*(6328)
3' (626)
iency. 244 (above the threshold)
GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
III  I I I I MINI
(610)5'
Priming efficiency. 193 (above the threshold)
5'(6328 )   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3*
3(5125) (5108)5'
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	g	g	g	g	g	g	g	g	g	g	g			
AHP2 cDNA (TAIR database)!
Sequence: AT3G29350.1 Date last modified 2007-04-17 Name AT3G29350.1 Tail Accession   Sequence:40 10737427 Sequence Length (lip) 827
1 ACAATTCGCG AGAAAGACAA AACACAAGTT TCTTCTTCTT GGGATTGGCT 51 ATTTCCAGAA ATCCAAGTCA ATAATCAAAG TCCAAACAAA AAAATCCTCT 101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA AC T AAA GAGA 601 CTAGTCCATA AGAAGAAAAA AG AT GATGAC TTTCTTTCTT TAGTTTCTCT 651 TCTAAATTAT TTTGGATTTG GTGTTTGCTC AAAAACTCAA TAAAATATGT 701 GCAAAAAGAA ACAAAAACAA GTGATGGTTG TTTATAAATC AGTAGTATGT 751 ATTGTTTGAT CTCATCCGAG AAAATTGAAA CCATTGGACT AATGAATGTG 801 ATGATAATAT ATATTGGTTT GCTTCTG
□ ODODOnononon ODODODononono
□ ODODOnononon
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA ACTAAAGAGA
EcoRI restriction site
5 ......GIAATTC......3
3"......CTTAA G......5'
Design of primers
AHP2 ex_np
5'- CCG GAA TTC ATG GAG GGT CTC ATT GCT C AG - 33
AHP2ex_low
5'- CCG GAA TTC TTA GTT A AT ATC C AC TTG AGG - 3'
ODODODODODODO DODODODODODOD
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DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTQVTGGAC GCTCTCATTG CTCÄČJCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAC 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTfľCTCAA GTGGATATTA ACŤÄ^AGAGA
EcoRI restriction site
5'......G| AATTC......3
3"......CTTAA G......5
Design of primers
AHP2ex_up
53- CCG GAA TTC ATG GAG GCT CTC ATT GCT C AG
33
AHP2ex_low
5'- CCG GAA TTC TTA GTT A AT ATC C AC TTG AGG - 3'
LITERATURA
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- Laboratory Methods in Enzymology 529: DNA Explanatory Chapter: PCR Primer Design (2013)
■ Oliqo 7 Power Point Presentation http://www.oliao.net/tutorials.html
- PCR Primer Design; IMBB Workshop, N. Ndegwa (2013)
■ PCR Primer Design; A. Yuryev (2010)
■ https://lanadalelab.files.wordpress.com/2015/07/deaenerate-primer-desiqn.pdf
■ OLIGO Primer analysis software, Version 7
- PCR Primer: A Laboratory Manual (2003)
■ Artificial DNA: Methods and Applications; Khudyakov, Y.E., Fields, W.A., Ed.
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UtJUUUUUL)U(JU(JU
ododododododo
□ odododododoo ododododododo
□ odododododoo ODODODOnonono
dodododododod
AutoDimer (Vallone and Butler. 2004). http://www.cstl.nist.gov/ strbase/NlJ/ An roDimer.htm
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Online-( iuides/LINNliA-('.c)innuiiiities/Vectc>r-NTI-C()ninuinity/Vector-
NTI.html
Visual OMP™. http://dnasoftvvare.com/tabid/ 108/Default.aNpx
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Discovery is not in seeking new landscapes, but in having new eyes...
Marcel Proust
Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiký'(CZ. 1.07/2.3.00/09.0132)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
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