1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • Luděk Bláha, PřF MU •Testování ekotoxicity - BIOTESTY OPVK_MU_stred_2 figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Co je to biotest ? nNástroj (metoda, postup …), kdy živý organismus (tkáň, populace, systém …) je vystaven (= exponován), ve víceméně kontrolovaných standardních podmínkách působení sledovaných stresových faktorů (chemické látce) a sleduje se účinek či jev n nPrvní biotesty – „ochutnávači“ faraonů nDnes téměř na všech typech organismů n nTest toxicity – sleduje se toxický účinek nTest bioakumulace – sleduje se jev nEKOtoxikologický (bio)test = vyhodnocuje EKOtoxicitu n n •2 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •EXPERIMENTÁLNÍ HODNOCENÍ EKOTOXICITY 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Proč ekotoxikologické testy ? n CHEMICKÉ ANALÝZY samotné NEDOKÁŽOU postihnout reálné riziko pro živé organismy: n n1) reálná expozice se liší podle biodostupnosti toxických prvků a látek v dané situaci, n2) jde vždy o směs toxikantů, která působí jinak než jednotlivé toxikanty zvášť n3) Negativní vlivy matrice samotné bez ohledu na obsah toxikantů na živé organismy či interakce vlivu matrice s efekty toxikantů n4) spektrum analytických metod (tedy i limitních hodnot) je omezené a ve vzorku mohou být přítomny neanalyzované významně toxické látky. n •4 PŘEDNOSTI chem. analýz - Reprodukovatelnost, standardizovanost - Exaktní číselné výstupy srozumitelné laikům: využití v zákonech 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Vývoj biotestů nNejstarší biotesty – akutní efekty, ekologicky nerelevantní, většinou pro hodnocení čistých látek, např. pesticidů nModerní vývoj směrem k: nSubletálním efektům nZvyšování ekologické relevance testů nOd chemických látek k environmentálním směsím nZdokonalování testů: časové, miniaturizace nZjednodušování koncovek testů – mikrodestičky, fluorescence … nKomerčně dostupné tzv. „kity“ (např. www.microbiotests.be) •5 1 http://www.ebpi.ca/thamnocephalus%20platyurus%20toxicity%20test%20kit.jpg http://www.teara.govt.nz/files/p15500pc.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Rozdělení biotestů nDle trofické úrovně testovacích organismů: ntesty s producenty, konzumenty, destruenty nPodle doby trvání expozice a povahy efektů: nakutní, semiakutní (semichronické), sub-akutní, chronické nkonkrétní délka závisí na generační době organismu (bakterie <<< pstruh), klasifikace není zcela jednotná. Dělení zpravidla na: nakutní = 24, 48 až 96 hod, zpravidla hodnocení letality nchronické – dny, týdny až měsíce, hodnocení neletálních efektů nDle počtu zapojených druhů: njednodruhové (single species), dvoudruhové, vícedruhové (multi-species) nDle úrovně biologického systému: nenzymy, biosondy, buněčné a tkáňové kultury in vitro, intaktní živý organismus, populace, mikro/mezokosmos, terénní experimenty nDle generace: ntesty 1. generace, 2. generace (mikrobiotesty), 3. generace (biosenzory, biosondy ..), 4. generace – online systémy … n •6 figure4 Eisenia_fetida scenedesmus_quadricauda_upr http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/32/EscherichiaColi_NIAID.jpg/210px-Escherichi aColi_NIAID.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Rozdělení biotestů nDle typu vzorku: nchemická látka, směs látek, přírodní vzorek z prostředí nDle testované matrice: nvoda, půda, vzduch, sediment, odpad, chemická látka nDle úpravy vzorku: nvýluhové (org. rozpouštědlo, DMSO, voda …), kontaktní (Solid Phase Tests), přímé (Direct tests, Whole effluent test), TIE – toxicity identification evaluation nDle hodnoceného účinku: ntesty mortality, reprodukční testy, únikové testy, růstové testy, testy teratogenity, karcinogenity, xenoestrogenity apod. nDle provádění: nin situ a in vitro n+ biotesty procesů: bioakumulace, biokoncentrace, biodegrace •7 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Standardizovanost, legislativa … nZákonem předepsané testy nVelmi málo, zejména pro nové chemické látky, pesticidy, odpady nVelký boom využití biotestů v posledních letech – ekologická kriteria kvality prostředí nNormované, standardizované nMnoho testů nNormovanost ≠ povinnost, závaznost nEkonomické důvody – akreditace laboratoří nExperimentální rovina nŘada testů nProstor pro snahy o ekologickou realističnost nUplatnění nových poznatků o mechanismech a efektech nEkologické studie •8 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Normované, standardizované testy nCíl: snížit mezilaboratorní variabilitu nčasem byly vypracovány standardní postupy pro hodnocení efektů v laboratorních testech až pro metody bioindikací in situ n nVýhody: nzaručení jednotnosti a opakovatelnosti výsledků npři dodržení postupu srovnatelnost výsledků z různých laboratoří nvalidované výsledky vhodné pro rozhodování nmalá nutnost optimalizace nNevýhody: nvelmi specifická a omezená vypovídací hodnota ("akutní letalita pro korýše Daphnia") nzpravidla vhodné jen pro zařazení (klasifikace) toxicity látek (více –středně – méně toxické ...) nomezený počet standardizovaných postupů, zpravidla jednoduché (akutní) efekty •9 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Organizace spojené s biotesty nOECD = Organization for Economic Cooperation Development nISO = International Standardization Organization nUS EPA = US Environmental Protection Agency nSETAC = Society for Environmental Toxicology and Chemistry nIOBC = International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants nEPPO = European and Mediterranean Plant Protection Organization nASTM = American Society of Testing and Materials nCEN = European Commitee for Standardization nWHO = World Health Organisation nBBA = Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft nOPPTS = The Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (EPA) nDIN = German Deutsches Institut für Normung nČSN = Česká státní norma n •10 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •STANDARDY : Globálně nejvýznamnější jsou OECD Guidelines •http://www.oecd.org 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •OECD Guidelines – sekce „2“ Effects on biotic systems (= Ekotoxikologické testy) (2013 - celkem 37 standardizovaných návodů v této sekci; další sekce např. humánní toxicita) • •Detaily k vybraným (nejčastěji užívaným) testům à viz dále 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif OECD – příklady nhttp://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html n •13 Organisation for Economic Co-operation and Development Test No. 201: Alga, Growth Inhibition Test 11 July 2006 Test No. 221: Lemna sp. Growth Inhabition Test 11 July 2006 Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test 23 Nov 2004 Test No. 211: Daphnia magna Reproduction Test 16 Oct 2008 Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test 17 July 1992 Test No. 204: Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study 04 Apr 1984 Test No. 210: Fish, Early-Life Stage Toxicity Test 17 July 1992 Test No. 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages 21 Sep 1998 Test No. 215: Fish, Juvenile Growth Test 21 Jan 2000 Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay 08 Sep 2009 Test No. 230: 21-day Fish Assay 08 Sep 2009 Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay 08 Sep 2009 Test No. 209: Activated Sludge, Respiration Inhibition Test (Carbon and Ammonium Oxidation) 23 July 2010 Test No. 224: Determination of the Inhibition of the Activity of Anaerobic Bacteria 25 Jan 2007 Testy s vodními organismy http://www.fishbase.org/images/species/Darer_m0.jpg http://www.oecd.org/env/ehs/testing/oecdguidelinesforthetestingofchemicals.htm 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif OECD - příklady nhttp://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html n •14 Organisation for Economic Co-operation and Development Testy s půdními organismy Test No. 208: Terrestrial Plant Test: Seedling Emergence and Seedling Growth Test 17 Aug 2006 Test No. 227: Terrestrial Plant Test: Vegetative Vigour Test 17 Aug 2006 Test No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests 04 Apr 1984 Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test 23 Nov 2004 Test No. 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) 23 Nov 2004 Test No. 228: Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies(Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) 16 Oct 2008 Test No. 232: Collembolan Reproduction Test in Soil 08 Sep 2009 Test No. 226: Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil 16 Oct 2008 Test No. 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test 21 Jan 2000 Test No. 217: Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test 21 Jan 2000 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0b/Redwiggler1.jpg/240px-Redwiggler1.jpg http://www.falw.vu.nl/en/Images/Folsomia%20candida_tcm24-30644.jpg http://www.zuova.cz/sluzby/kontaktni-testy-toxicity2.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/02/Helix_aspersa-Nl2A.jpg http://beetlespace.wz.cz/druhy/fotky/Oxythyrea_funesta_01.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif ISO 20079:2005 Water quality -- Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) -- Duckweed growth inhibition test ISO 8692:2004 Water quality -- Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae ISO/CD 16191 Water quality - Determination of the toxic effect of sediment and soil on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum - Myriophyllum test ISO 10253:2006 Water quality -- Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum ISO 10710:2010 Water quality -- Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne ISO 14442:2006 Water quality -- Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water ISO/DIS 13308 Water quality -- Toxicity test based on reproduction inhibition of the green macroalga Ulva pertusa ISO/TR 11044:2008 Water quality -- Scientific and technical aspects of batch algae growth inhibition tests Standardy biotestů - ISO ISO Logo •15 Vodní rostliny http://www.clean-flo.com/wp-content/uploads/pic-1.jpg http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/imgoct05/Scenedesmus-quadricauda.jpg http://www.algaebase.org/_mediafiles/algaebase/5B7BE95A076ca2C19Dsxv2CAFF8E/k857fWdJXeJD.jpg http://rostlinna-akvaria.cz/eshop/obrazky/366-Myriophyllum-matogrossense.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif ISO 6341:1996 Water quality -- Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) -- Acute toxicity test ISO 10706:2000 Water quality -- Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) ISO/DIS 14380 Water quality -- Determination of the acute toxicity to Thamnocephalus platyurus (Crustacea, Anostraca) ISO/CD 16303 Water quality -- Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca ISO 10872:2010 Water quality -- Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda) ISO 16712:2005 Water quality -- Determination of acute toxicity of marine or estuarine sediment to amphipods ISO 20665:2008 Water quality -- Determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia ISO 20666:2008 Water quality -- Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h ISO 14669:1999 Water quality -- Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea) ISO/DIS 14371 Water quality -- Determination of freshwater-sediment subchronic toxicity to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda) ISO 16665:2005 Water quality -- Guidelines for quantitative sampling and sample processing of marine soft-bottom macrofauna ISO 7828:1985 Water quality -- Methods of biological sampling -- Guidance on handnet sampling of aquatic benthic macro-invertebrates ISO 8265:1988 Water quality -- Design and use of quantitative samplers for benthic macro-invertebrates on stony substrata in shallow freshwaters ISO 8689-1:2000 Water quality -- Biological classification of rivers -- Part 1: Guidance on the interpretation of biological quality data from surveys of benthic macroinvertebrates ISO 8689-2:2000 Water quality -- Biological classification of rivers -- Part 2: Guidance on the presentation of biological quality data from surveys of benthic macroinvertebrates ISO 9391:1993 Water quality -- Sampling in deep waters for macro-invertebrates -- Guidance on the use of colonization, qualitative and quantitative samplers ISO/DIS 10870 Water quality -- Guidelines for the selection of sampling methods and devices for benthic macroinvertebrates in fresh waters ISO/WD 16778 Water quality -- Calanoid copepod development test with Acartia tonsa Standardy biotestů - ISO ISO Logo •16 Vodní bezobratlí http://pcwww.liv.ac.uk/~stewp123/Daphnia%20magna.jpg http://84.244.151.141/~persoone/images/slider/Thamnocephalus_platyurus.jpg http://www.fcps.edu/islandcreekes/ecology/Arthropods/Scud/Hyaellallam1.jpg http://caramelosblog.es/wp-content/gallery/fauna/caenorhabditis_elegans_worm.jpg http://cfb.unh.edu/CFBKey/html/Organisms/PRotifera/GBrachionus/brachionus_calyciflorus/brachionusca lyciflorus1large.jpg http://www.dr-ralf-wagner.de/Bilder/Heterocypris_incongruens-50x_17.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Standardy biotestů - ISO ISO Logo •17 Suchozemské rostliny ISO 11269-1:1993 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth ISO 11269-2:2005 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants ISO 17126:2005 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Screening test for emergence of lettuce seedlings (Lactuca sativa L.) ISO 22030:2005 Soil quality -- Biological methods -- Chronic toxicity in higher plants ISO/CD 29200 Soil quality -- Assessment of genotoxic effects on higher plants -- Micronucleus test on Vicia faba http://media-2.web.britannica.com/eb-media/69/10269-004-EEF044DB.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e1/Illustration_Vicia_faba1.jpg/240px-Illustr ation_Vicia_faba1.jpg http://lh3.google.com/luirig/R5yaRJTetsI/AAAAAAAAOL8/WO5-p8bmIQE/s800/sinapis_alba_2.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Standardy biotestů - ČSN •18 Voda UNMZ ČSN EN ISO 10253 Jakost vod - Zkouška inhibice růstu mořských řas Skeletonema costatum a Phaeodactylum tricornutum ČSN EN ISO 11348-2 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 2: Metoda se sušenými bakteriemi ČSN EN ISO 11348-3 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s lyofilizovanými bakteriemi ČSN EN ISO 11348-3 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s lyofilizovanými bakteriemi ČSN EN ISO 15088 Jakost vod - Stanovení akutní toxicity odpadních vod pro jikry dania pruhovaného (Danio rerio) ČSN EN ISO 20079 Jakost vod - Stanovení toxických účinků složek vody a odpadní vody na okřehek (Lemna minor) - Zkouška inhibice růstu okřehku ČSN EN ISO 8692 Jakost vod - Zkouška inhibice růstu sladkovodních zelených řas ČSN ISO 20665 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity pro Ceriodaphnia dubia ČSN ISO 20666 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity pro Brachionus calyciflorus během 48 h ČSN ISO 10706 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) ČSN ISO 12890 Jakost vod - Stanovení toxicity pro embryonální a larvální stadia sladkovodních ryb - Semistatická metoda ČSN EN ISO 9509 Jakost vod - Zkouška toxicity pro hodnocení inhibice nitrifikace mikroorganismy aktivovaného kalu ČSN EN ISO 8192 Jakost vod - Zkouška inhibice spotřeby kyslíku aktivovaným kalem při oxidaci uhlíkatých látek a amoniakálního dusíku ČSN EN ISO 16712 Jakost vod - Stanovení akutní toxicity mořských sedimentů nebo sedimentů estuárií pro obojživelníky 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Obecné vlastnosti biotestů •19 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Optimální vlastnosti biotestu nstandardizovatelnost, opakovatelnost, variabilita npraktická proveditelnost, cena, rychlost ncitlivost nvypovídací hodnota, použitelnost pro ochranu ŽP nekologická relevance: nexpoziční cesta npřirozený výskyt použitého druhu, zastává funkci v ekosystému nsledované odpovědi indikovat stav a funkci organismu nživotní stádium použitého organismu, celý cyklus nživotní strategie organismu nživotní forma nekologické nároky daného organismu vs podmínky testu n n •20 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Design a vlastnosti biotestu nBiotest má určité parametry, charakteristiky, standardní podmínky nNa druhou stranu má určité nejistoty, zdroje variability n nZákladní parametry biotestů: nKomplexnost biologického systému nDoba expozice nUspořádání expozice nExpoziční scénář nBiologický systém – organismus, druh nDalší specifika biologického systému nHodnocený parametr, endpoint nDalší abiotické faktory v experimentu n •21 figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Akvatické testy - expozice nRozdělení dle uspořádání expozice nstatické (bez výměny roztoků - možné změny koncentrací, kyslíku) nstatické s obměnou média (výměna v definovaných časech, á 24 h) nrecirkulační (recirkulace média, technicky náročnější ...) nprůtočné (kontinuální udržování koncentrací, technicky náročné ...) n nObvykle expozice celých organismů (příjem povrchem těla, dýchacím aparátem, potravou) méně často: jednorázové injekce (ryby, vstup a dávka nejsou ovlivněny prostředím) n n •22 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Půdní testy - expozice npůda, sedimenty – bakterie, bezobratlí – kontakt celým povrchem (testy přímého kontaktu - solid phase tests) nReálná půda/sediment nArtificiální půda/sediment nrostliny – kořeny - kontakt s pevným nebo kapalným médiem, expozice plynným polutantům ze vzduchu nterestričtí živočichové - specifické expoziční scénáře: ninjekce ("klasická" toxikologie – obratlovci – laboratorní hlodavci, ptáci), i.p. / i.m. / i.v. / s.c. npotrava – dávkování v potravě, aplikace gaváží (trubice přímo do žaludku) nrespirace – kontaminace vzduchu – uzavřené nádoby/cely, inhalace nčasto lze reálně předpokládat několik expozičních cest současně n •23 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •24 Expozice v pevné matrici nVelké odlišnosti od akvatických testů nPevné matrice jsou dosti heterogenní nObsahuje vždy všechny tři fáze PEVNOU, KAPALNOU (pórová voda) a PLYN (vzduch) nPřítomnost pevné fáze zejména má významný vliv na OSUD a CHOVÁNÍ chemické látky nV závislosti na vlastnostech látky, vlastnostech půdy a čase dojde k DISTRIBUCI látky v půdě, případně vzniku SPECIÍ nStěžejním procesem je SORPCE a důsledkem je klíčový faktor půdních testů (eko)toxicity – BIODOSTUPNOST nTo vše má fatální důsledky pro výslednou toxicitu a riziko nDůsledkem je i ztížená extrapolace mezi půdami, z akvatických testů na půdní a z laboratorních testů na reálnou situaci Půdní prostředí má svá specifika, především … … důsledkem je prostorová distribuce a výskyt různých forem – vázané, rozpuštěné, sekvestrované v nanopórech apod. U kovů je pak velmi výrazná SPECIACE Biodostupnost hraje klíčovou roli v ekotoxikologii půdních organismů 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •25 Schéma expozice v půdním prostředí 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Organismy v biotestech nPožadavky nsnadná dostupnost (laboratorní kultury, komerční dostupnost ...) nsnadné uchování a chov v laboratorních podmínkách do dostatečných množství pro experimenty nbiologie druhu a genetika příslušné kultury jsou charakterizovány njsou prostudovány relativní citlivosti druhu / kultury k různým třídám toxických látek ncitlivost druhu by měla být dobrým representantem příslušné skupiny organismů (Daphnia – korýši, Paví očko – sladkovodní ryby, kaprovití) n •26 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Další specifikace testovacího organismu nvýsledek stanovení toxicity a interpretaci ovlivňuje řada dalších biologických parametrů n ngeneticky podmíněná citlivost příslušné kultury / klonu / variety ... nvelikost a stáří jedinců npohlaví nvývojové stadium (vajíčka, embrya, larvy, dospělci ... nfyziologické podmínky – optimum (choroby, potrava – antioxidanty ...) n •27 1 figure4 figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Hodnocené parametry - endpointy nbiotesty akutní toxicity nživočichové - nejčastěji hodnoceným parametrem je letalita, dále imobilizace (Daphnia) nautotrofové – řasy: růst, dělení, množství chlorofylu (fluorescnence); rostliny cévnaté – klíčení, růst ndestruenti – bakterie: růst, metabolická aktivita ... n nbiotesty chronické toxicity nživočichové – neletální parametry – růst, malformace, reprodukční schopnosti a úspěšnost (testy reprodukce) nautotrofové –cévnaté rostliny – klíčení, růst, tvorba gamet/semen, rozmnožování ... n •28 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory/podmínky biotestu nMají významný vliv na výsledky – vliv na modelový organismus, vliv na expozici (ovlivnění biodostupnosti a formy kontaminantů) nJejich nadefinování je součástí standardizace testu nteplota nsvětlo, světelná perioda nobsah a přístup kyslíku npH ntvrdost vody (!) (akvatické experimenty n •29 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Praktická realizace biotestu - obecně n1) Příprava organismu nkultivační médium, standardní počty, stáří ... n2) Příprava vzorku nředění vzorku (mimo nádoby s organismy) – koncentrační řada ředící medium: nvoda/medium – lze přímo přidávat k organismům norganické rozpouštědlo – přídavky jen malých koncentrací (0.5%) npříprava kontaminované půdy nnegativní kontrola – ředicí medium n3) Expozice npřídavky vzorku (kontrolního roztoku) k organismu, expozice (24, 96 h) npřídavky organismu do připravené matrice n4) Vyhodnocení nstanovení letality / růstu, srovnání vzorek – kontrola, odvození křivky dávka odpověď, statistické srovnání n •30 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •1) Příprava organismu • • •2) Příprava vzorku • • • • • • • • • • • •3) Expozice • •4) Vyhodnocení • Praktická realizace biotestu - voda •31 \\Cba010\X\paul\Metody\Schema testu Ps_putida.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •32 Testy obecně nPředběžný test - hledáme rozmezí používaných koncentrací (ředící faktor 10; např. 0,1 - 1000 mg/kg); mortalita většinou hlavní endpoint hodnocený po 2 týdnech n nFinální test - výstupem je funkce závislosti účinků na koncentraci testované substance (jemnější škála; nejlépe s faktorem 2); hodnoceny přežití dospělců po 3 týdnech (mortalita - akutní test) a počty juvenilů po 6 týdnech (reprodukce - reprodukční test) n nNOEC design – méně koncentrací, ale více opakování - 5 koncentrací po 4 opakováních a kontrolní varianta (bez chemické látky, na rozpouštědlo apod.) n nEC/LC design – více koncentrací, méně opakování – regresní metody 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Výběr baterie testů •33 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Baterie testů nOdpověď všech organismů na toxikant není stejná nVlivy ovlivňující finální efekt se liší – biodostupnost, expoziční cesty, metabolizace toxikantu, citlivost n nV praxi nelze používat pouze jediný biotest nVětšinou je potřeba sestavit podle určité logiky baterii testů nČím více testů v baterii, tím menší nejistota při vyhodnocení dopadů na ekosystém (v hodnocení rizik pak nižší faktor nejistoty) n nZákladní pravidlo = pokrýt trofické úrovně nDalší důvody (různé expozice, délky testů, typy efektů …) n nV praxi většinou kompromis mezi „vědeckou“ správností a praktickými potřebami (cena, čas …) •34 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Baterie biotestů nOrganismus v daném biotestu je reprezentant větší skupiny organismů nVýběr konkrétního testu a celé baterie závisí na CÍLECH stanovení (ty musí být jasné před zahájením studie): nNapř. "ochrana hospodářsky významných druhů ryb", "ochrana kvality půdy – aktivity půdních mikroorganismů", "ochrana vody před toxickým odpadem" … n •35 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Výběr biotestů dle organismu ndle ekologické funkce organismu (producenti, saprofágové, destruenti, konzumenti, predátoři ...) ndle typu organismu (červi vs. členovci, mikroorganismy vs. bezobratlí …) ndle trofické příslušnosti organismu (herbi -, omni -, bakteri -, fungi -, carni-voři) ndle expoziční povahy organismu (epi -, endo-geické) ndle životní historie organismu (délka života) ndle ekologické strategie organismu (r a K strategie) n •36 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •37 Příklad – baterie testů pro odpady nExistují ISO normy určující výběr testů n nISO 15799 (2003): Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials nISO 17616 (2008): Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological characterization of soils and soil materials 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •13 zemí •59 laboratoří •5 základních testů •9 přídavných testů •půl tuny odpadů (3 vzorky) Příklad baterie biotestů: EU ringtest 2006-2007 •38 nCíle: nzhodnotit standard EN 14735 nvyhodnotit aplikovatelnost baterie testů n n n n n n nVýstupy: nKniha, report a zejména příprava nového EN standardu: WI 292050: Characterisation of waste – Guidance on the use of ecotoxicity tests applied to waste MCj01965320000[1] Ecotoxicological Characterization of Waste 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif EU - Základní sada testů •39 WORM4_1.JPG (50221 bytes) 359 vibrio_fischeri_1145457864 [] 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif EU - Rozšířená sada testů •40 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Akvatické testy ekotoxicity •41 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Spektrum testů akvatické ekotoxikologie nJe obrovské – akvatická ekotoxikologie byla dlouhou dobu „jedinou ekotoxikologií“ nTesty (i standardizované) dnes pokrývají celou škálu úrovní: nsuborganismální úroveň n laboratorní experimenty: studium mechanismů toxicity látek, in vitro biomarkery, odhady míry subletální toxicity specifických typů (dioxinová toxicita, xenoestrogenita ...) njednotlivé druhy organismů, jednotlivci nlaboratorní experimenty: tradiční ekotoxikologické biotesty s jednotlivými druhy organismů, porovnání citlivosti různých druhů ... npopulační efekty nlaboratorní testy - dlouhodobější experimenty – celoživotní testy toxicity,testy s časnými vývojovými stadiemi, rostliny – rozmnožování, klíčení ..., bezobratlí – obratlovci – testy reprodukční toxicity n •42 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •- PŘÍKLADY – PRODUCENTI - figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Testy s producenty nEkotoxikologické biotesty využívající producenty (fotoautotrofní organismy) lze označit také jako testy fytotoxicity nPoznámka/doplnění: fytotoxiny jsou toxiny produkované rostlinami (alkaloidy, glykosidy, antibiotika atd.); stejně jsou chápány mykotoxiny (toxiny produkované plísněmi a houbami), cyanotoxiny (toxiny produkované sinicemi) apod. n nCo se sleduje? nLetalita, inhibice růstu, nebo fyziologických procesů nGenotoxicita, mutagenita: řasy i cévnaté rostliny - detekce chromozomových zlomů, tvorby mikrojadérek, iniciace nádorů na kořenech, poruchy tvorby kutikuly, mutace na úrovni intaktní rostliny, tvorba DNA aduktů atd. nHodnocení detoxifikační aktivity, přítomnost a aktivita detoxifikačních systémů ( PCR, ELFO, LC-MS, formy glutationu, SOD apod. nHodnocení vlivu toxikantů na rezistenci k patogenním organismům nHodnocení biokumulací a biokoncentrací toxikantů v přírodním prostředí nHodnocení podílu autotrofních organismů na detoxifikaci/ imobilizaci toxických látek v životním postředí (bioremediace pomocí cévnatých rostlin, nebo cyanobakterií) •44 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Producenti – řasy a sinice nSinice (fotosyntetizující gramnegativní eubakterie) koloniální (Microcystis), vláknité (Anabaena, Nostoc) a pikocyanobakteria jednobuněčné (Synechocystis) ndusík fixující sinice jsou velmi citlivé na toxické látky a inhibice nitrogenázy patří mezi vhodné endpointy nŘasy - jednobuněčné, cenobiální, vláknité, sladkovodní, mořské nKromě klasických biotestů s jednou řasou, jsou používány tzv. Multispecies algal asays (paralelní kultivace zástupců zelených řas, sinic a rozsivek dle podmínek zkoumané lokality) nFyziologické testy (hodnocení fotosyntetické aktivity, enzymatické aktivity) nKompetice a reprodukce přírodních populací fytoplanktonu a fytobentosu nŘasy a sinice hodnotíme většinou pomocí změny počtu buněk v čase experimentu ve srovnání s kontrolou, případně pomocí koncentrace pigmentů (např. chlorofylu a), fyziologické aktivity (příjmu živin) a metabolické aktivity (fotosyntetické aktivity, enzymatické aktivity ) •45 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif http://images.google.com/images?q=tbn:Qyps3ofRsaAC:protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Sel enastrum/Selenastrum.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:3Uk_pnNg7FYC:www.biol.tsukuba.ac.jp/~inouye/ino/g/chl/Scenede smus.GIF http://images.google.com/images?q=tbn:o1Gy7R1nLxoC:www.iopan.gda.pl/chemia/bch/scen_acumi.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:0DGs5snqycAC:protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Sce nedesmus/Scenedesmus.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:LyDPHFdHZFEC:www.naturalways.com/graphics/chorell1.gif http://images.google.com/images?q=tbn:p94EnK4aEN0C:www.hamburg.de/Behoerden/Umweltbehoerde/Badegewa esser/bad_hh/chlorella.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:j8d5Afk824IC:protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Sti chococcus/minor_1.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:SU19llUZVoAC:www.durr.demon.co.uk/microcystis%25202.jpg •46 Producenti – řasy a sinice figure4 figure4 •Microcystis aeruginosa 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Producenti - řasy nŘasové testy toxicity nstandardní uspořádání: n96 hod, Erlenmayerovy lahve, třepání nsledování růstu, počtů buněk, biomasy – kvantifikace chlorofylu (fluorescence) nminiaturizace nmikrodestičky nŘasy nSelenastrum capricornutum nScenendesmus subcapitatus nSc. quadricauda nChlorella vulgaris nSinice nMicrocystis aeruginosa n •47 figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Producenti - řasy http://www.biorem.lu.se/images/algalabsmall.jpg http://www.imp.mtu.edu/matchar/algal1.JPG http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/labtour/algacult.gif http://images.google.com/images?q=tbn:SFBLBvbVuqoC:www.aquatic.uoguelph.ca/Human/Research/vwxyz/ima ges/wegerh.jpg http://www.dnr.state.sc.us/marine/mrri/shellfish/images/algae1.jpg •48 http://www.ftns.wau.nl/prock/Research/Rene/Picture/alpha_1.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:n1jWhOTIX8IC:www.sunwellness.com/images/FlaskSeedCulture.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:XULBG1MgmTcC:www.butbn.cas.cz/ccala/sbirka.jpg figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Producenti - řasy nŘasové testy toxicity nALGALTOXKIT (TM) nSelenastrum capricornutum nAlternativní mikrobiotest nminiaturizace nrychlá dostupnost živých řas (alginátové kuličky) n n •49 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Řasový test toxicity (ISO 8692) nPodstata: inhibice růstu jednodruhového řasového kmene kultivovaného v přesně stanovených podmínkách v koncentrační řadě zkoušené látky nZkušební organismus – planktonní zelené řasy Scenedesmus subspicatus Selenastrum capricornutum nVoda – u živného substrátu a roztoku zkoušených látek se používá deionizovaná voda nebo voda obdobné jakosti nŽiviny a jejich roztoky: 4 zásobní roztoky dle daných koncentrací, sterilizované membránovou filtrací nebo v autoklávu (4. roztok ale nelze) •50 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Řasový test toxicity (ISO 8692) nPostup zkoušky: nZásobní roztok živin – vždy čerstvý, před použitím 30 min provzdušňovat nebo ponechat přes noc v kontaktu se vzduchem nPomocí hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové se pH upraví na hodnotu 8,3±0,2 nPříprava inokula – 1díl zásobního roztoku na 8 dílů vody, který se doplní inokulační kulturou v exponenciální fázi růstu na koncentraci 10 000 buněk/ml nVolba koncentrační řady – dle předběžné zkoušky... nPříprava zásobních roztoků zkoušené látky – roztok, který dále ředíme nPříprava zkušebních roztoků – výsledný objem by měl být stejný n6x kontrola, 3x každá koncentrace nInkubace: nTeplota 23±2°C nBílé světlo od 400 nm do 700 nm, 6 000 – 10 000 lx. nTřepat, míchat nebo provzdušňovat –zajištění výměny plynů a udržení pH. nMěření: nMinimálně po 24 hod., vzorek odebrat pipetou a nevracet zpět nUkončení nejdřív po 72 hodinách •51 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Řasový test toxicity (ISO 8692) nMiniaturizace – sérologické destičky nRozměr 9x12 cm, 96 jamek o objemu 0,25 ml nPraktická ukázka s dichromanem draselným nkoncentrační řada: 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 a 0,3125 mg/l; nZBB médium sterilizované v autoklávu; nzkušební organismus Scenedesmus subspicatus nosvětlení standardní zářivka 40 W nEC50 = 5,5 mg/l nNOEC = 2,5 mg/l •52 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Producenti - řasy •53 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Příklad – ekotoxicita cytostatik •(Zounková et al. 2010 Chemosphere 81:253-260) •5-Fluorouracil • • • •Cytarabin • • • • •Gemcitabin • • Metabolity 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Inhibice růstu řas – cytostatika •(Zounková et al. 2010 Chemosphere 81:253-260) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Producenti vodní – vyšší rostliny nTest s okřehkem (ISO 20079; OECD 221) nLemna minor (Lemna gibba), 2-5 lístků nstandardní uspořádání: n 96 hod – 1 týden, 24 °C, 6-10 tis lx, pH 6,5 n kádinky 150 ml n10 lísků/kádinku n vyhodnocení růstu, biomasy, počtu lístků – srovnání s kontrolou nlze využít analýzy obrazu nvalidace: nprůměrný počet lístků v kontrole vzrostl 8x npH se nezměnilo po dobu testu více než o 1,5 nIC50 pro K2Cr2O7 je 10-60 mg/L n n •56 figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - KONZUMENTI – BEZOBRATLÍ - figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Konzumenti - Bezobratlí njsou velmi běžné, někdy je ekotoxikologie zaměňována s "Daphniovými biotesty„ nstandardní uspořádání nkádinky, akutní testy 48 h, prolongované testy 21 d nhodnocení letality, růstu ... nkrátkodobé - zpravidla statické nAkvatičtí planktonní korýši - nejčastější nDaphnia magna, Ceriodaphnia dubia, Artemia salina (mořská) nDalší bezobratlí nbentičtí – Gammarus, Hyallela azteca nmáloštětinatci – Tubifex, Lumbriculus nplži - písečník nhmyz – Pakomáři (Chironomus), jepice ... n •58 C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\figure4.jpg 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\figure4.jpg •Daphnia magna C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\figure4.jpg •Artemia salina •Ceriodaphnia dubia C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif •Gammarus C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\figure4.jpg •Chironomus riparius •59 Konzumenti - Bezobratlí •Potamopyrgus antipodarum •Písečník novozélandský •Tubifex tubifex •Nítěnka obecná http://www.aquarium-kosmos.de/bilder/streifzuege/Lumbriculus%20variegatus_2.jpg •Lumbriculus variegatus 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkity") s bezobratlými •www.microbiotests.be • • •60 Konzumenti - Bezobratlí • •Daphtoxkit - obsahuje tzv. efipia což jsou zvláštní chitinová pouzdra uzavírající zimní vajíčka (dormantní stádia perlooček) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Daphnia magna test (ISO 6341) nPodstata testu nZjišťuje se počáteční koncentrace účinné látky, která za 24/48 hodin imobilizuje 50% testovaných jedinců n24h -> 24h EC50 n48h -> 48h EC50 nPodmínky zkoušky nTma nebo fotoperioda 16h světlo/8h tma nLátky podléhající rozkladu na světle testovat ve tmě nTeplota 20°C ± 2°C nBez toxických výparů či prachu ovlivňujících průběh testu •61 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Daphnia magna test (ISO 6341) nChov nKrmíme 1x denně mikroskopickou řasou nDo testu nasazujeme jedince mladší 24 hodin nV předstihu (2-3 dny) odlovíme gravidní samice do samostatné nádrže nPo vylíhnutí síťkou lovíme narozené jedince a nasazujeme ihned do testu nŘedící voda = medium nCaCl2 · 2H2O 11,76 g/l nMgSO4 · 7H2O 4,93 g/l nNaHCO3 2,59 g/l nKCl 0,23 g/l nKaždou navážku rozpustíme v 1l destilované vody npH roztoku 7,8 ± 0,2 nZ každého ze 4 zásobních roztoků odebereme 25ml a doplníme destilovanou vodou na 1l nPřed použitím v testu provzdušňujeme do nasycení •62 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Daphnia magna test (ISO 6341) •63 C:\DOCUME~1\MARTIN~1\LOCALS~1\Temp\\msotw9_temp0.bmp C:\DOCUME~1\MARTIN~1\LOCALS~1\Temp\\msotw9_temp0.bmp 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Chronický test na Daphnia magna daphnia •ČSN ISO 10706 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) • • • • • • • • organismy mladší 24h • 10 organismů na koncentraci • individuálně v 50ml media M4/kádinku • médium výměna 3x týdně • expozice 21 dní • • teplota 20 ± 2°C • pH 6-9 (±1,5) • rozpuštěný O2 > 3mg/l • fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy • krmení směs řas • Jednou týdně: O2, teplota, tvrdost a pH v médiu, kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace. • 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Sledované parametry nMortalita, přežívání nReprodukce nPočet narozených juvenilů nDen první reprodukce nChování - způsob pohybu n další parametry (zbarvení, tukové kapénky, velikost gonád) - měření délky matečných organismů na konci zk. - velikost a počet potomků jednoho organismu - počet potracených plůdků,… Chronický test na Daphnia magna 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Daphnia magna akutní vs chronický test •66 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Zounkova, R., Z. Kliemesova, L. Nepejchalova, K. Hilscherova and L. Blaha (2011). "Complex Evaluation of Ecotoxicity and Genotoxicity of Antimicrobials Oxytetracycline and Flumequine Used in Aquaculture." Environmental Toxicology and Chemistry 30(5): 1184-1189. Příklady výsledků – D. magna 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Cytostatika – toxicita pro D. magna •(Zounková et al. 2010 Chemosphere 81:253-260) •Akutní toxicita – imobilizace •Reprodukční toxicita 5-FU •Fig. 1. Ecotoxicity (concentration–response curves) of the studied cytostatic drugs •and their metabolites. (A) Daphnia magna acute immobilization test. •Fig. 2. Effects of 5-fluorouracil (5-FU) on the reproduction of Daphnia magna (numbers of offsprings) in the 21-d chronic test. Příklady výsledků – D. magna 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - - BEZOBRATLÍ – SEDIMENTY – 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif magic Jak hodnotit toxicitu sedimentů? nToxicita porové vody/výluhů (několik ISO / OECD norem) •100 g d.w./L vody, 24h pomalé třepání, filtrace, test •V. fisheri (30 min), řasy, bezobratlí - D. magna (2 dny) • ? Vodný výluh vs. Sediment • • • • • •Doporučeny nejméně 2 různé druhy (např. Hyalella, Chironomus, Daphnia, …) a dva různé sledované parametry (např. růst, přežití, reprodukce...) nKontaktní toxicita (jen málo norem …) •: sedimenty+organismy & hodnocení účinků – červi, hmyz, šneci … dny - týdny • • 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA •www.epa.gov 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif magic Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA •www.epa.gov 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Chironomus test (OECD 218) nModelový organismus: Pakomár Chironomus sp. (samec k rozeznání dle ochmýřených tykadel) n •73 • • •Chironomus yoshimatsui • • •Chironomus tentans • • •Chironomus riparius 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Chironomus akutní test nNasazovány larvy ve stadiu 2-3 instaru (cca 10 d staré) n10 jedinců/kádinku n100 ml sedimentu/175 ml vody nTeplota 20 ± 2°C nPravidelné krmení, vzduchování nFotoperioda 16 h světla / 8 h tmy nSledováno pH, kyslík, vodivost nPo 10 dnech hodnoceno přežívání a růst n •74 IMG_0059 IMG_0054 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif magic Tubifex tubifex - Nitěnka obecná nSoučást makrozoobentosu nRelevantní organismus pro sediment nInhibice pohybu a letální koncentrace n n •kmen: KROUŽKOVCI • třída: opaskovci • podtřída: máloštětinatci • • • • • • • •Akutní test •Účel: •Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitěnky. Nitěnky patří mezi nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy. •Princip: •Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek v odstupňovaných koncentracích látky ve srovnání s kontrolou v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prolongovaný 10-14 denní test •Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace • • • • • 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif magic •trvání •4 týdny (popř. 8 týdnů) •nádoba •objem 1 l •médium •800 ml vody •expozice •statická, 50 g sedimentu •odběry •20 jedinců po 4 (8) týdnech •parametry •mortalita; změny v morfologii pohl. orgánů; počet embryí, poměr embryí bez ulity a s ulitou •+ nízké nároky na kultivace •- nedostatečná velikost pro biochemické analýzy Potamopyrgus sediment test Také zástupce předožábrých plžů. Nechtěně introdukován do oblasti Sev. a Baltského moře s balastní vodou z Nového Zélandu. V původním areálu obě pohlaví, v Evropě partenogeneze. 3-4 generace za rok, množení 10 000/rok 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - - KONZUMENTI – OBRATLOVCI – figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Konzumenti , dravci - obratlovci nRybí biotesty nstandardní uspořádání: nakvária n akutní testy 96 h, prolongované a embryolarvální testy dny až měsíce nhodnocení letality, růstu, rozmnožování ntesty karcinogenity (nádory) ntesty xenoestrogenity (vývoj oboupohlavníků) nrůzná uspořádání (statické, průtočné ...) nRybí druhy nPstruh duhový, Živorodka duhová (paví očko), Karas, Kapr, Střevle (Pimephales promelas) nSpecifické testy (endokrinní disrupce, karcinogenita) nHalamčík rýžovištní – Japanese medaka n •78 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Používané druhy Oncorhynchus--mykiss-1 •Brachydanio rerio, Danio rerio (danio pruhovaný, zebřička pruhovaná) • • • • •Poecilia reticulata (živorodka duhová, paví očko) • • • • Zebra Danio •Pimephales promelas (střevle potoční) • • • • Cyprinus carpio (kapr obecný) • • • •Oncorhynchus mykiss (pstruh duhový) Poecilia-reticulata6 Pimephales_promelas_1.jpg (14kb) Karpiowate - Carp (Cyprinus carpio) Image result for fish toxicity test guidelines OECD 215 OECD 203 OECD 236 OECD 229, 230 F x M OECD 234 OECD 240 F x M 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Akutní testy •ČSN EN ISO 7346-1 (75 7761) Jakost vod – Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) – Část 1: Statická metoda •ČSN EN ISO 7346-2 (75 7761) Jakost vod – Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) – Část 2: Obnovovací metoda •ČSN EN ISO 7346-3 (75 7761) Jakost vod – Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) – Část 3: Průtočná metoda • •OECD 203: Test akutní toxicity na rybách – výsledkem je koncentrace, která vyvolá 50% úhyn ryb (96h LC50) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif 82 •82 •24 h •48 h •72 h •96 h ZF-Embryo lupeneu •Endpoints for mortality: •Coagulation, lack of somite, •non-detached tail, lack of heartbeat ünewly fertilised zebrafish eggs (20/concentration + water control + positive control + solvent control) üat least 5 concentrations. •The new OECD TG 236 was adopted in July 2013: •24-well plates •(glass or polysterene) FET is considered as an alternative to the fish adult test for animal welfare reasons n26 July 2013 - Test No. 236: Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test nConsidered as alternative to acute toxicity assay NO. 203 Image result for fish embryo toxicity test 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Embryonální test s Danio rero (OECD 236) •Expozice - od vajíčka (1-3 h po oplodnění) do max 4-5 dní • (spotřebovává žloutek a nepřijímá externí potravu) • •Realizace (dle OECD) v 24-jamkových deskách • 20 vajíček individuálně v jamkách á 2 mL média • •Vyhodnocení – mortalita, pohyby, délka, morfologické změny • • •Testy s rybami – nahrazování dospělců: využití embryí •(embrya nejsou z hlediska zákona považována za „obratlovce“) ca 50b P0001 •Viz: výukové video a další materiály à IS.MUNI.CZ 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif OECD testing guidelines http://www.oecd.org/env/ehs/testing/seriesontestingandassessmentecotoxicitytesting.htm n28 July 2015 - Test No. 240: Medaka Extended One Generation Reproduction Test (MEOGRT) nFrom F0 (3 weeks) à via F1 (15 weeks) à F2 (2-weeks posthatching) nsurvival, gross development, growth and reproduction (fecundity) nmechanistic information - vitellogenin, secondary sex characteristics, histopathology n Image result for medaka fish life cycle 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Image result for fish toxicity test guidelines OECD 215 OECD 203 OECD 236 OECD 229, 230 F x M OECD 234 OECD 240 F x M 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Obratlovci - obojživelníci nFETAX – Frog Embryo Teratogenicity Assay Xenopus nDrápatka (Xenopus laevis), http://drapatka.ic.cz/ nUspořádání: ntoxikologie – experimenty s vajíčky, embryi a larvami - petriho misky n96 h (dosažení stadia larvy bez žloutk. vaku) n nVýznam: nTest teratogenity nNení nutné povolení na testy s obratlovci nmožná extrapolace výsledků na jiné organismy včetně savců s 85% pravděpodobností •86 C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Xenopus life cycle frog_pict 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Obratlovci - žáby •88 1 • 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Palíková, M., S. Navrátil, B. Maršálek and L. Bláha (2003). "Toxicity of crude extract of cyanobacteria for embryos and larvae of carp (Cyprinus carpio, L.)." Acta Vet. Brno 72: 437-443. • 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Dvořáková, D., K. Dvořáková, L. Bláha, B. Maršálek and Z. Knotková (2002). "Effects of cyanobacterial biomass and purified microcystins on malformations in Xenopus laevis: teratogenesis assay (FETAX)." Environmental Toxicology 17(6): 547-555. • 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Fig. 1. Mortality in the 96-h FETAX test after exposure to purified microcystin-LR (MLR) and the biomass of cyanobacterial •water blooms: •(A) Dose–response curves of purified MLR (scale in g/L on X axis), biomass containing natural microcystins (bloom dominated by Microcystis •aeruginosa), and biomass with no detectable microcystins (bloom dominated by M. wesenbergii; scale milligrams of •biomas d.w. per liter on X axis). Concentrations of purified MLR and the M. aeruginosa biomass are proportional (e.g., •12 mg of the biomass d.w. contained 10 g of MLR). •(B) Toxic effects of externally added MLR (25–250 g/L) to the cyanobacterial biomass with no natural microcystins. • •Asterisks •(**) indicate statistically significant difference from the effect of the biomass (300 g/L) with no MLR addition •(Pearson’s chi-square, p 0.01). Bars represent means standard error of the mean of two independent experiments •each performed in two parallels. 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif n08 Sept 2009 - Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay nXenopus laevis, Starts with stage 51 nAfter 7 days - measurement of the length of the hind-limb nTermination (21 days) - developmental stage, snout-to-vent and hind limb lengths Image result for Amphibian Metamorphosis Assay OECD testing guidelines - AMPHIBIANS http://www.oecd.org/env/ehs/testing/seriesontestingandassessmentecotoxicitytesting.htm 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif n 28 July 2015 - Test No. 241: The Larval Amphibian Growth and Development Assay (LAGDA) nXenopus laevis, starts with tadpole stages 8-10 n16 weeks ngrowth, development, metamorphosis, sex maturation Image result for xenopus embryo development stages Image result for Amphibian Metamorphosis Assay Image result for xenopus embryo development stages OECD testing guidelines - AMPHIBIANS http://www.oecd.org/env/ehs/testing/seriesontestingandassessmentecotoxicitytesting.htm 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - -MIKROBIÁLNÍ TESTY TOXICITY - 1c 1 1b • •MICROBIAL ZOO •DIRTLAND •WATERWORLD 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • •(1) TEST AKUTNÍ TOXICITY - MICROTOX - mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri - krátkodobá expozice testované látce (5-30 min) - sledování změn přirozené luminiscence – odpovídá toxicitě - - uspořádání: kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru - • •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty figure4 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •(2) Růstové testy toxicity s bakteriemi - - stanovení efektu toxické látky v médiu na růst bakterie - Pseudomonas putida, Escherichia coli ... - - expozice 16 hodin - kultivace bakterií (Erlenmayerovy nádoby, miniaturizace – mikrodestičky) - vyhodnocení – nárůst biomasy (zákal) - - • •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Zounkova, R., Z. Klimesova, L. Nepejchalova, K. Hilscherova and L. Blaha (2011). "Complex Evaluation of Ecotoxicity and Genotoxicity of Antimicrobials Oxytetracycline and Flumequine Used in Aquaculture." Environmental Toxicology and Chemistry 30(5): 1184-1189.0 •Flumequine •OTC 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • •(3) Bakteriální testy GENOTOXICITY -často užívané biotesty hodnocení genotoxicity čistých látek i směsí - horší extrapolace pro člověka -> nemají metabolizační enzymy: bioaktivace (modifikace – externí přídavky S9 frakcí) - -3.1 Amesův test – (různé kmeny Salmonella typhimurium) - mutanti neschopní žít v minimálním mediu (chybějící enzym pro syntézu His) : genotoxin vyvolá reverzní mutace à bakterie přežívají - hodnocení – počítání kolonií revertantů na Petriho miskách - • •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty 1b - -3.2 Další specifické testy - specifické transgenní bakterie s reporterovým genem pod kontrolou reparace DNA - Př. 1 gen pro luciferázu (recA test) - à mutace: měření luminescence 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Zounkova, R., Z. Klimesova, L. Nepejchalova, K. Hilscherova and L. Blaha (2011). "Complex Evaluation of Ecotoxicity and Genotoxicity of Antimicrobials Oxytetracycline and Flumequine Used in Aquaculture." Environmental Toxicology and Chemistry 30(5): 1184-1189.0 •Flumequine •OTC 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •100 Půdní biotesty 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty s mikroorganismy 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Testy s půdními mikroorganismy •Soil sampling •Storage •Pre-incubation •(7 days) •START •Substance application •Negative •control •Positive •control •7th day • • • •14th day • • • •21st day • • •28th day •Microbial parameters • • • 10 g per replicate aerobic conditions 60% WHC; 22°C; dark OECD 216 (2000) Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test OECD 217 (2000) Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test ISO 14238 (1997) Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Endpointy v mikrobiálním testu nStandarně pouze mineralizace dusíku a uhlíku jako produkci CO2 a sumy minerálních forem dusíku (NH4+, NO2-, NO3-) n nLze ale stanovit i další parametry: nMikrobiální biomasu nSubstrátem indukovanou respiraci nEnzymatické aktivity nKinetiku mineralizace C a N nAmonifikaci, nitrifikaci nDiverzitu n nVýstupy: NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ... 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty s bezobratlými 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Žížaly v ekotoxikologii nžížaly jsou asi nevíce a nejdéle ekotoxikologicky užívaný představitel půdní fauny n nVýhody a důvody: ncelý vývojový cyklus probíhá v půdě - typický geobiont nzkonzumují velká množství půdy (vysoká expozice potravou a akumulace kontaminantů) nmají velmi úzký fyzikální kontakt s půdou (expozice pokožkou) nmají výrazné bioakumulační a biokoncantrační charaktery (jejich analýzou posuzujeme vliv delšího časového období) = patří mezi tzv. makrokoncentrátory nvysoký a významný podíl na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, půdní úrodnosti nklíčové postavení v přenosu polutantů v potravních řetězcích nvýskyt téměř ve všech půdách ve vysokých počtech i váhách nosvědčené, zavedené v laboratorních testech (nenáročný chov) nsnadno se identifikují v reálných vzorcích (díky velikosti) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •106 Žížaly 01 05 06 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif V různých testech různé endpointy nMortalita nReprodukce nZměny váhy nBehaviorální změny nMalformace nFyziologické změny nSnížení imunity nAktivity enzymů nBiochemické markery nGenotoxicita n…. 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif n • Eisenia Cycle Eisenia fetida nVýhody nStandardní druh nSnadná kultivace velkých počtů nKrátký životní cyklus CE8c mating LR CE8a-cocoon LR Lumdiap2 STUPD00Z http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR7-3EeXeOV0fHO4s2TOGWEnFANnR74gi6jRAso6-WCvT_OWvmIZlw3FsoM yA 11 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif WHC vesselsready controlwithworms wormsweighing wahingwormsJPG •Příprava půd •Měření WHC půd •Ovlhčená AS rozvážená do testovacích nádob •Výběr 10 reprezentativních adultů z chovu a jejich omytí dH20 •Zvážení jedinců •Přídavek 10 adultů do nádoby na test drysoils Eisenia fetida reprodukční test - začátek 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif wormssearching wormsweighing bottomofvessel •Prohlídka nádob (známky aktivity) •Zhodnocení mortality •Zvážení žížal trolleywithworms •Nádoby během testu v kontrolované místnosti E. fetida test – po 28 dnech 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif waterbathS • juvenileszoomedS juvpicking cocoonsievingS cocoonsearchontray cocoonsinthehand •Po cca 20 min juvenilové na povrchu •Vodní lázeň s narůstající teplotou 40ºC až 60ºC •Přesátí půdy •Sbírání a počítání •Počítání •Ruční třídění kokonů E. fetida – po 8 týdnech 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif 38 62 71 019 012 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Earthworm Avoidance Test •Guideline: ISO/DIS 17512 (draft) •Species: E. fetida / E. andrei •Substrate: LUFA St. 2.2 standard soil •Duration: 1 - 2 days •Parameter: Behaviour of the worms •Test vessels: Dual chamber DSC07739 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Další modelové organismy – půdní bezobratlí grindal_worm Roupice (např. Enchytraeus crypticus) Chvostoskoci (např. Folsomia candida) Hlístice (Caenorhabditis elegans) body1a Plži, např. Helix pomatia (hlemýžď zahradní), Arion ater (plzák) 散大蜗牛 hwg00077 Prospěšní členovci (testy pesticidů) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ • •Další biotesty s terestrickými bezobratlími • •VČELY - - testování insekticidů - dávkování v potravě - - •Moucha domácí Drosophila (hodnocení genotoxicity) - figure4 figure4 1 figure4 •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Terestrické prostředí nAkutní orální toxicita pro včelu medonosnou nMetoda C.16 podle přílohy směrnice 2001/59/ES nPodstata metody: ndospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozptýlené do cukerného roztoku nkaždé zkušební skupině včel se podá 100-200 μl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku npo spotřebování potravy (3-4 hod) se odebere krmící zařízení a nahradí se zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok, který mohou přijímat dle libosti nmortalita se zaznamenává denně během alespoň 48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami •116 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty s vyššími rostlinami 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Testy s vyššími rostlinami nvelké množství – obtížná přehlednost ndřívější testy zaměřené na klíčivost semen a elongaci kořene jsou označovány jako poměrně necitlivé a málo relevantní pro ekologii npro relevantnější interopretace byly vyvinuty testy vícegenerační s možností studia subletálních účinků n nNejpoužívanější endpointy n 1.Klíčivost semen (půdní roztok) - nerelevantní 2.Elongace kořene (půdní roztok či půda) 3.Růst sazenic 4.Produkce biomasy 5.Životní cyklus (změny hmotnosti, počet květů, semen ..) 6.Enzymatický test 7.Fyziologické testy (fotosyntéza, respirace) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif nsemena jsou exponovány v substrátu (křemenný písek), půdě toxické látce či přímo v kontaminované půdě z terénu a po 5 dnech se sleduje klíčivost - direct test nrelativně necitlivý: semeno má bariéry pro vstup látky a energeticky je soběstačné, látka ho nemůže stresovat npostupy se v detailech liší, někdy bývá přímo spojen (US EPA) se sledováním délky kořene njindy se ale vliv na délku kořene sleduje jako nepřímá expozice v roztoku n •Test inhibice růstu kořene Sinapsis alba n72 hodin jsou semena vystavena roztoku látky (+kontrola) n20°C; 5ml roztoku na petriho misku; 30 semen na misku; tma nstanoví se délka kořene a počet vyklíčených semen •hypokotyl •délka kořene Testy klíčivosti a elongace kořene 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Postup salát setý Germination tests with plants – testing toxicity in the aquatic media (Sinapis alba) or in soil (Lactuca sativa) P1010052 pokus IMG_0215 IMG_0196 IMG_7021_al IMG_7034 ISO 11269-1 IMG_7022_al 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Vyšší rostliny IMG_0511 IMG_0499 IMG_0819 IMG_0825 •ISO 22030 (2005): Chronic toxicity in higher plants plant01.jpg (54.086 Byte) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxicita PAHs a jejich N-derivátů pro rostliny •(Pašková et al. 2006 Environmental Chemistry and Ecotoxicology 25:3238–3245) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxicita PAHs a jejich N-derivátů pro rostliny •(Pašková et al. 2006 Environmental Chemistry and Ecotoxicology 25:3238–3245) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxicita PAHs a jejich N-derivátů pro rostliny •(Pašková et al. 2006 Environmental Chemistry and Ecotoxicology 25:3238–3245) 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Hodnocení GENOTOXICITY s využitím rostlin • -uspořádání - mikroskopické hodnocení chromozomových aberací v rychle rostoucích buňkách •(kořenová špička) - bob setý, cibule (Allium cepa) • - expozice kořenů do vodných roztoků (extraktů), nebo půdních vzorků •Ekotoxikologické biotesty - producenti 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Terestrické prostředí - obratlovci •127 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ • •Ekotoxikologické testy s ptáky - -uspořádání - dietární testy toxicity, dávkování v potravě - krátkodobé (5 dní expozice + 3 dny) - reprodukční testy – dlouhodobé (týdny) • •Hrabaví ptáci, křepelky • •Křepelka virginská (1) •(Northern bobwhite, Collinus virginianus) • •Křepelka japonská (2) (Japanese quail, Coturnis japonica) • •bažant, kur domácí, kachny ... figure4 figure4b 1 1 •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci figure4 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxikologické testy s laboratorními zvířaty Myš, Potkan, Křeček, Morče - -uspořádání - spíše humánní toxikologie, ale může být využito jako model pro přírodní hlodavce - dávkování – injekčně, inhalace, potrava - délka trvání: nejčastější akutní test – i.p. injekce 24 hod sledování - další testy – až 96 hod, dlouhodobé až 3 měsíce - kompletní testy karcinogenity 3 roky - řada specifických testů (embryotoxicita, teratogenita, imunotoxicita, kožní iritance ...) • • figure4b figure4c •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Experimentální design • •28 dní expozice v potravě 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Účinky microcystinu (toxin sinic) – skupiny 10 a 11 • à snížení hemoglobinu (A), zvýšená reakce na vakcinu (B)