KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Metody Jiří FAIMON KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Metody studia koloidních systémů: •Metody izolace koloidních částic –ultrafiltrace, ultrafiltry, membrány, –chromatografické gely, kolonová chromatografie, gelová filtrace, gelová chromatografie •Studium koloidů po jejich separaci –elektronová mikroskopie, –neutronová aktivační analýza, –plynová chromatografie •Studium koloidů bez separace –Thyndalův jev, optické metody, spektrofotometrie KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •STUDlUM KOLOIDNÍ FÁZE bez separace koloidní fáze, •využívajicích různych jevů - např. –rozptylu resp. difrakce světla na částicích (např. Fitch a Watson 1979, Zollars 1980, Fedin 1983, Melik a Fogler 1983, Bowen et al. 1985, Gee et a1.1990, Penders et al. 1991, Schnablegger a Glatter 1993), –spekter (Bottero et al. 1980, Cary et al. 1982, Browne a Driscoll 1992), nebo –pohyblivosti částic (např. Asakava et al. 1992, Mangelsdorf a White 1992). KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •DaIší používanou metodou je rozlišení jednoduchých látek od polymerních (koloidních) za pomoci spektrofotometrických metod: •Jednoduché iony jsou stanoveny spektrofotometricky (křemík - viz. napr. Truesdale a Smith 1976, TIer 1979, Otterstedt et al. 1986; hlinik - viz. Hydes a Liss 1976, Yokoyama et al. 1987, 1991) a celkový obsah sledovaného prvku se stanoví některou instrumentální metodou (AAS, ICP). Obsah vyšších polymerů a koloidů lze určit z rozdílu. •Tato metoda je však vhodná spíše pro modelové experimenty s jedinou, jasně definovanou složkou. Při analýze složitých směsí, např. produktů zvětrávání, popř. přírodních vod, muže docházet k chybám, protože reakce spektrofotometrických činidel jsou jen zřídka dostatečně selektivní. KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Druhou možností, je separace koloidni faze (bud' izolací koloidních částic nebo naopak odstraněním jednoduchých nízkomolekulárních látek z koloidních roztoků) a její zkoumáni běžnými instrumentálními metodami – •v roztoku (ICP, AAS) •v tuhé formě (SEM, EDXR) •Kromě speciálních separačních metod, jako jsou isotachoforéza, elektroforéza (PuIs et al. 1990, 1991, PuIs a Powell 1992) a různých variant ultracentrifugace (Beckett et al. 1988, Li a Caldwell 1990, Hoffman 1991) se nejběžněji používá –ultrafiltrace –různé formy vylučovací chromatografie –„cross flow“ separace KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Ultrafiltrace •K definování horní hranice rozměru koloidních částic bývá aplikována ultrafiltrace. •Tato metoda (napr. Sigleo a Helz 1981, Hunter 1982, Sigleo et al. 1982, Means a Wijayaratni 1982, VonGunten et al. 1987, Degueldre et al. 1988, PuIs et al. 1990, 1991, Waber et al. 1990, PuIs a Powell 1992) využívá k separaci membránové filtry s přesně definovaným rozměrem póru, kterými mohou procházet jen částice do určitého rozměru (oblast dělení, dělící hrana), resp. molekulových hmotností (dále jen MW). •Podrobný rozbor procesu a zdrojů chyb při ultrafiltraci lze nalézt v práci Danielsona (1982). KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Zařízení pro ultrafiltraci • Přípravek se skládá ze dvou skleněných protikusů se zabroušenými čely. V čele jednoho z nich je přitmelená frita, na niž je vkládána filtrační membrána. Obě části zařízení jsou spojeny přes pryžové podložky aluminiovou přírubou a čtyřmi šrouby. •Roztoky vzorku byly vpravovány do horní části zařízení injekční stříkačkou a pak, po připojení přívodu z tlakové lahve, filtrovány pod přetlakem 30kPa dusíku. KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Ultrafiltrace – membránové filtry KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Separace částic aerosolu F3 F2 Atmogeochemická aparatura Filtrační koláč KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Chromatografické metody –kolona –stacionární fáze –mobilní fáze • •Dělení na principu rozdílných •afinit rozpuštěných látek (v •mobilní fázi) ke stacionární fázi • • • • • KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Gelová filtrační chromatografie •Chromatografická metoda, částice jsou separovány podle velikosti (hydrodynamického objemu) • •Size Exclusion Chromatography (SEC) • –Gel Permeation Chromatography (GPC) – Mobilní fáze: organická rozpouštědla •Distribuce organických polymerů • –Gel Filtration Chromatography (GFC) •Mobilní fáze: vodné roztoky •Frakcionace proteinů a dalších ve vodě rozpustných polymerů •Dělení koloidních částic KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Stacionární fáze: Dextranový gel •Dextran –polysacharid – molekuly glukózy spojených do řetězců různé délky •Sephadex –obchodní název pro „cross-linked“ dextranový gel • • Křížem pospojované řetězce polymeru. Polymerace do 3-rozměrné sítě - labyrint pórů KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Catalog Number Description Bead size (µ) Sephadex Gel-Filtration Resins 27,103-9 Sephadex G-10 40-120 27,104-7 Sephadex G-15 40-120 27,106-3 Sephadex G-25 20-50 27,107-1 Sephadex G-25 20-80 27,109-8 Sephadex G-25 50-150 27,110-1 Sephadex G-25 100-300 27,112-8 Sephadex G-50 20-50 27,113-6 Sephadex G-50 20-80 27,114-4 Sephadex G-50 50-150 27,115-2 Sephadex G-50 100-300 27,116-0 Sephadex G-75 20-50 27,117-9 Sephadex G-75 40-120 27,118-7 Sephadex G-100 20-50 27,119-5 Sephadex G-100 40-120 27,121-7 Sephadex G-150 40-120 27,123-3 Sephadex G-200 40-120 Sigma-Aldrich KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Sephadex •různý stupeň porozity •průměr perel 20 až 300µ. • –Sephadex® G-100 •for gel filtration, 20-50 μm •Replaced by G10050, Sephadex® G-100 •®Pharmacia Biotech AB •Properties: for gel filtration •bead size: 20-50 μm •pore size: 1,000-100,000 fractionation range: M.W. •Sephadex is a registered trademark of Amersham Biosciences, Inc. •WGK Germany 3 • •Průchod mobilní fáze kolonou: –malé molekuly difundují do pórů gelu, jsou zadržovány –velké částice se tam nevejdou a prochází přímo. Výsledek: velké částice jsou rychleji eluovány! KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ 271187 Aldrich Sephadex® G-100 for gel filtration, 20-50 μm This product number has been discontinued but a similar product may be available. Please select the recommended replacement product below (if a direct replacement is available) or use the links to "similar products" or "related product categories" to see other possible replacement products. Recommended Products Replaced by G10050, Sephadex® G-100 Price and Availability Click For Pricing and Availability CAS Number 9050-94-6 EG/EC Number EINECS MDL number MFCD00132235 Expand/Collapse All Descriptions Legal Information ®Pharmacia Biotech AB Sephadex is a registered trademark of GE Healthcare. Properties grade for gel filtration particle size 20-50 μm pore size 1,000-100,000 fractionation range: M.W. trademark Sephadex is a registered trademark of Amersham Biosciences, Inc. References reference RegBook 1 (3), 3565:J Safety Safety Statements 22 WGK Germany 3 271187 Aldrich Sephadex® G-100 for gel filtration, 20-50 μm This product number has been discontinued but a similar product may be available. Please select the recommended replacement product below (if a direct replacement is available) or use the links to "similar products" or "related product categories" to see other possible replacement products. Recommended Products Replaced by G10050, Sephadex® G-100 Price and Availability Click For Pricing and Availability CAS Number 9050-94-6 EG/EC Number EINECS MDL number MFCD00132235 Expand/Collapse All Descriptions Legal Information ®Pharmacia Biotech AB Sephadex is a registered trademark of GE Healthcare. Properties grade for gel filtration particle size 20-50 μm pore size 1,000-100,000 fractionation range: M.W. trademark Sephadex is a registered trademark of Amersham Biosciences, Inc. References reference RegBook 1 (3), 3565:J Safety Safety Statements 22 WGK Germany 3 SEM images of air dried LH-20 resin beads coated with AuPd. (Magnifications: Top row: Left 878X, middle 7000×, right 28100×. Bottom row: Left 37500×, middle 75000×, right 120000×) KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ (a) SEM images of the SP-30 resin coated with AuPd at different magnifications (10000×on the left and 40000×on the right). (b) AFM images of SP-30 resin with different scan sizes (2 μm on the left and 10 μm on the right). KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Princip gelové permeční chromatografie KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Zařízení pro gelovou permeační chromatografii. Analyzovaný roztok je tlačen přes kolonu naplněnou gelem KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Eluční křivka: látky z nejvyšší MW jsou vylučovány nejdříve – v nejmenším elučním objemu KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ •Gelová filtrace •Koloidní fáze lze z roztoku separovat gelovou filtrací (dále jen GF), - specielní varianta gelové filtrační/permeační chromatografie (dále jen GFC), (podrobně viz. např. Determann 1967, Kirkland 1979, Yau et al. 1979, Ragel a Janson 1992, Faimon a Ondracek 1993). •Na rozdíl od běžné GFC, při které dochází k rozdělení makromolekul s rozdílnou molekulovou hmotnosti (MW) do řady objemových frakcí (např. Crerar a Axtmann 1981), se v GF rozděluje vzorek pouze na dvě frakce: (1)makromolekularní (koloidní,obsahující vyšší polymery, resp. koloidy (2)nízkomolekularní (monomerní, obsahující jednoduché molekuly, ionty, popř. polymery s nízkou MW. KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Kolona pro gelovou filtraci Kalibrace kolony: (1) Vysokomolekulární látka Blue dextran: Vysokomolekulární dextran obsahující modré barvivo chlorotriazin (Cibacron Blue) Blue Dextran: Void volume marker for gel filtration columns Descriptions: Average mol. wt. of 2,000,000 D Extent of labeling: ~ 0.1 mmol Reactive Blue 2 per g dextran WGK Germany (2) Nízkomolekulární látka •rhodanid železa •metyloranž KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Zařízení pro gelovou chromatografii KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Dělení koloidních částic gelovu filtrací Koloidy v životním prostředí •(Asymmetric) Field-Flow Fractionation, FFF •(Dělení v systému pole-tok) •Princip: rychlost laminárního proudění u stěny kanálu se blíží nule! •Pohyb rozpuštěných molekul/koloidních částic je v tomto regionu zpomalován ve srovnání se středem kanálu •Molekuly/částice jsou tlačeny ke stěně kanálu externím polem aplikovaným kolmo k ose toku v kanálu. Různé částice/molekuly jsou zadržovány různou silou, podle intenzity interakce s polem. •Aplikovaná pole –Teplotní gradient (thermal FFF) –Elektrické pole –Sedimentační/gravitační pole (SFFF) –Flow/průtokový gradient (FFFF) •Výhody oproti ostatním konvenčním metodám separace částic: –Vysoké rozlišení srovnatelné s ultracentrifugací –Flexibilní separace nehomogenních/polydisperzních vzorků –Velký rozsah od několika nanometrů k několika mikrometrům KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Směs velkých a malých částic na počátku dělení Aplikace „příčného“ pole tlačí částice ke stěně kanálu Velké částice jsou přitlačeny větší silou – jsou blíže stěny, menší rychlost transportu, zpomalení průchodu kanálem Koloidy v životním prostředí Field-flow fractionation channel showing laminar flow profile and field perpendicular to flow (Chittleborough et al. 2004) Koloidy v životním prostředí •Flow Field-Flow Fractionation (FFFF / 4 F) •(dělení v systému „tokové pole“ - tok) •Metoda byla vyvinuta pro separaci makromolukul a koloidních částic. •Roli příčného pole přebírá příčné proudění média/rozpouštědla. Příčné proudění prochází semipropustnou membránou (nepropustná pro dělené molekuly/částice) KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Order-No:. Type Cut off Quantity CM 01 Y Reg. Cellulose 1.000 1 CM 01 Y A4 Reg. Cellulose 1.000 DIN A4 CM 02Y Reg. Cellulose 3.000 1 CM 02 Y A4 Reg. Cellulose 3.000 DIN A4 CM 03Y Reg. Cellulose 10.000 1 CM 03Y A4 Reg. Cellulose 10.000 DIN A4 CM 04C Reg. Cellulose 5.000 1 CM 04C A4 Reg. Cellulose 5.000 DIN A4 CM 05C Reg. Cellulose 10.000 1 CM 05C A4 Reg. Cellulose 10.000 DIN A4 CM 06C PES 5.000 1 CM 06C A4 PES 5.000 DIN A4 CM 07C PES 10.000 1 CM 07C A4 PES 10.000 DIN A4 CM 08S Polysulfon 5.000 1 CM 08 S A4 Polysulfon 5.000 DIN A4 CM 09S Polysulfon 10.000 1 CM 09S A4 Polysulfon 10.000 DIN A4 List of Membranes (ConSenxus): Schematic diagram of AFFFF system. Song et al., 1999. (Bull. Korean Chem. Soc., 20(10), 1159-1164) Koloidy v životním prostředí General setup of the Flow FFF channel for elemental analysis by ICP-AES and ICP-MS (Chittleborough et al. 2004) Koloidy v životním prostředí The Eclipse is a state-of-the-art separation system using the Asymmetric Flow Field Flow Fractionation (AFFFF) technique. Koloidy v životním prostředí The Eclipse is a state-of-the-art separation system using the Asymmetric Flow Field Flow Fractionation (AFFFF) technique. Koloidy v životním prostředí The Eclipse is a state-of-the-art separation system using the Asymmetric Flow Field Flow Fractionation (AFFFF) technique. Koloidy v životním prostředí Fractograms of three protein standards with (a) UV detection (b) ICP-MS detection Channel flow and cross flow rates were 1.0 and 2.0 ml min−1, respectively. The ICP-MS fractogram shows 64Zn and 127I signals obtained. Siripinyanond and Barnes, 1999. (J. Anal. Atom. Spectrom., 1999, 14, 1527–1531) KOLOIDY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Fractograms of a mixture of carbonic anhydrase and alcohol dehydrogenase • cross flow rates of 2.0 (first curve) and 3.0 (secon curve) ml min−1 (a) UV detection (b) ICP-MS detection Siripinyanond and Barnes, 1999. (J. Anal. Atom. Spectrom., 1999, 14, 1527–1531) AFFFF fractograms of proteins (a)at pH = 3 (b)at pH = 7 (c) at pH =13 Flow conditions are Vdot = 1.01 mL/min and Vc = 3.41 mL/min (±0.05 mL). Carrier is tris buffer solution of I = 0.053 M. Song et al., 1999 (Bull. Korean Chem. Soc., Vol. 20, No. 10, 1159-1164). A sample fractogram showing the size distributions for suspensions of three different size beads Eluted with a power-programmed cross-flow field. Vaillancourt and Balch, 2000. (Limnol. Oceanogr., 45(2), 485–492. Element based size distribution of the 0.06-0.08 μm and <0.06 μm fractions of the Willalooka illite. Separation in a FFFF channel and on-line analysis by ICP-MS and ICP-AES (Chittleborough et al. 2004)