VÝVOJOVÁ GENETIKA
Prof. RNDr. Boris Vyskot, DrSc.
Biofyzikální ústav AV Brno
VÝVOJOVÁ BIOLOGIE
• je multidisciplinárním přístupem ke studiu
individuálního vývoje (ontogeneze) jako integrace
embryologie s cytologií a chronologicky později
i s genetikou a molekulární biologií
• embryologie je definována jako popisné (deskriptivní)
studium embryonálního vývoje
• cytologie studuje buněčnou strukturu a funkci
• genetika je vědou o dědičnosti
• molekulární biologie představuje především analytický
přístup myšlenkový i metodický
Historické pozadí embryologie
• Deskriptivní embryologie - detailní analýzy vývojových událostí
(4. st. př.n.l. Aristoteles, mikroskopicky od 17. st. M. Malpighi,
A. van Leewenhoek)
• Komparativní embryologie – studium anatomických změn
v průběhu vývoje odlišných organismů
(od 19. st. – E. von Baer, W. Haeckel, T. Boveri)
• Experimentální embryologie – studium kauzálních faktorů
či mechanismů vývoje postavením hypotéz
a jejich testováním manipulací s embryi
(od 19. st. - W. Roux, H. Driesch, H. Spemann)
• Molekulární embryologie – studium embryonálních procesů
na molekulárně-genetické bázi (od 2. pol. 20. st. – S. Brenner aj.)
Klasická embryologie se zabývá
hamletovskými otázkami biologie
Caspar Friedrich Wolff (1733-1794) studiem embrya kuřete potvrzuje
vznik nových struktur z „bezstrukturního“ vejce, teorie epigeneze:
– odkud však pocházejí instrukce k budování složitého embrya ?
– jsou tyto instrukce vnitřního či vnějšího původu ?
– je nutné vysvětlovat embryonální organizaci magickou silou [vis
essentialis] ?
Theoria generationis ( 1759 )
Preformismus či epigeneze ?
uvnitř
vysvětluje princip
individuálního vývoje : výsledný
organismus není preformován,
nýbrž vzniká kreativně na základě
zděděné informace a vnitřních
i vnějších vlivů
Aristoteles
(384-322 př.Kr.)
- první pozorování vývojové biologie (kuřecí vejce)
- napsal první učebnici reprodukční biologie
- otec teorií vitalismu a epigeneze
- představy o vzniku nových organismů : ze substrátu, pučením,
hermafroditismem a bisexuální reprodukcí
EPIGENEZE
Preformismus
a mechanicismus :
Marcello Malpighi (1 628 - 1 694) … ovismus
Antoni van Leewenhoek (1 632 – 1 723) … animalculismus
… lidský zárodek je již vybaven všemi orgány …
William Harvey (London 1578-1657)
- autor moderní teorie epigeneze
- objevitel krevního oběhu
Pierre-Louis Moreau de Maupertuis (1698-1759)
genealogickou analýzou polydaktylie
vyvrátil teorii preformismu
Joseph Koelreuter (2. pol. 18. století) :
hybridizací dvou druhů tabáku prokázal
význam obou rodičů v potomstvu
Theodor Boveri (1862-1915)
Ascaris
DIFERENCIACE ZÁRODEČNÉ DRÁHY
A TEORIE MOZAIKOVÉHO VÝVOJE
jaderné determinanty
1. rýhování 2. rýhování
Augustin
Weizmann
(1834-1914)
Jean-Jacques Rousseau (1712-1778)
Letters on the Elements of Botany
(1773)
… Whenever you find them double, do not meddle
with them, they are disfigured… Nature will no longer
be found among them. She refuses to reproduce any
thing from monsters thus multilated: for if the more
brilliant parts of the corolla (petals), be multiplied,
it is at the expense of the more essential parts (sex organs),
which disappear under this addition of brilliancy…
Johann Wolfgang von Goethe
(1747-1832)
The Metamorphosis of Plants (1790)
… From first to last,
the plant is nothing but leaf …
The Red Model, René Margitte (1935)
William Bateson
(1861-1926)
Materials for the Study of
Variation (1894)
… HOMEOSIS is a particular
type of variation, in which
one member of a repeating
series assumes features that
are normally associated with
a different number …
Edward Lewis (1963) : pravidlo
spacio-temporální kolinearity
HOMEOTICKÉ GENY
jeden z klíčů specifikace a diferenciace
embryo dospělec
moucha
myš
Antennapedia Bithorax komplex
komplex (anterior) (posterior)
BITHORAX specifikuje třetí článek hrudi a
zadeček: ztráta funkce – místo kyvadélek
se tvoří druhý pár křídel
( more anterior phenotype )
Objev homeoboxu (1982)
Walter Gehring
(Basel)
Matthew Scott
(Stanford) vazba homeodomény Antennapedia na DNA
Thomas Hunt Morgan
(1866-1945)
Christiane Nuesslein Nature (1980) Eric Wieschaus
(*1942) (*1947)
Mořská ježovka : historický model fertilizace,
embryologie a buněčného klonování
Oscar Hertwig Hans Driesch
(1849-1922) (1876-1941)
dauerblastula pluteus
HISTORICKÉ KOŘENY VÝVOJOVÉ BIOLOGIE :
Hans Spemann a Hilde Mangoldová (1924)
Nobelova cena 2002 za fyziologii a lékařství
za objevy genetické regulace
orgánového vývoje
a programované buněčné smrti
… na modelu Caenorhabditis elegans
Sydney Brenner
(1927, JAR)
Robert Horvitz
(1947, USA)
John Sulston
(1942, UK)
Étienne Geoffroy Jonathan Slack
Saint-Hilaire (*1949, Bath)
(1772-1844, Paris)
druh I druh II
paralogní geny
genová duplikace
divergence druhů
další
evoluce
ZOOTYP ???
Xenopus
Amphibia
pijavice
ploštěnci
Drosophila
myš
ZOOTYP
původ „helix-turn-helix“ genů
původ homeoboxových genů
původ genových shluků Hox
zootyp (fylotypové stádium)
P
r
o
k
a
r
y
o
t
a
houby rostliny žahavci červi
vyšší
živočichové
OBECNÉ VÝVOJOVÉ PRINCIPY
- buněčná proliferace, tj. opakovaná buněčná dělení
- buněčná diferenciace,
vyskytující se v definovaném prostorovém pořádku
- tvorba tvarů, různé buněčné typy se vyskytují
v definovaných tvarech
- vývoj je určován i buněčnými pohyby
a buněčnou migrací
- programovaná buněčná smrt je také důležitým
ontogenickým faktorem
Přehled vývojových procesů
gamety
zygota
růst buněčné dělení diferenciace tvorba tvarů morfogeneze
vzrůst vzrůst diverzifikace organizace tvorba
velikosti počtu buněk buněčných typů struktur
dospělec
gamety
Lewis Wolpert
(*1929, London)
TEORIE POZIČNÍ INFORMACE :
MODELY VLAJEK
1 2 3 4 5 6
prahové
hodnoty
konc.
morfo-
genu
konc.
morfo-
genu
potenciál buněk je stejný
nová poziční informace
diferenciace dle pozice
Modely diferenciace a vytváření tvarů
Alan Mathison Turing
(London, 1912-1954)
The Chemical Basis of Morphogenesis (1952)
Jak vznikají barevné skvrny na zvířatech ?
modelování procesů morfogeneze
Alan Turing, 1952
Morfogeny :
aktivátor a inhibitor,
reakce a difúze
Osudy kanibalů (pozitivní aktivátor) a misionářů na bicyklech (negativní
inhibitor) – v omezeném prostoru vznikají enklávy kanibalů či misionářů, vznik
uspořádání tvarů z původně homogenního pole
ostrov:
pobřeží obydleno reakce a difúze vznik
smíšeně kanibaly uspořádání
a misionáři
PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT
je dobrovolné sebeobětování se buňky
ve prospěch vyvíjejícího se organismu (celku)
- apoptóza, nekróza, …
APOPTÓZA
programovaná
buněčná
smrt
jako morfogenní nástroj
tvorby tvarů
(pattern formation)
morfologie listu Monstera deliciosa
buněčná smrt
vývoj končetiny obratlovců a separace prstů
Princip zákonitosti a nahodilosti
ve vývojové biologii
Mají růstové pohyby zákonitý nebo náhodný směr ?
Je levo-pravo-stranná asymetrie dána pouze environmentálně ?
Který genetik vyřešil záhadu dědičnosti směru otáčení ulity měkkýšů ?
TRANSLAČNÍ
SYMETRIE
=
pravidelné opakování
(obvykle lineární)
základních jednotek
mnohobuněčných
organizmů
jednotka rovina symetrie
translační symetrie bez polarity
translační symetrie s polaritou
translace
podélná
rovina
článkovaná těla
rozrůzňování článků (homeotické geny)
vede k diferenciaci podél základních os : anterior-posterior, apical-basal
Má pravo – levá asymetrie svou inherentní podstatu ?
( Ne ) náhodná asymetrie
vývinu listů a květů
směr otáčivosti
je náhodný !
brčál oleandr
(L, anticlockwise ) ( R, clockwise )
směr otáčivosti není náhodný !
Směr otáčivosti ulity měkkýšů odpovídá maternálně
determinovanému rýhování
pravotočivé (R) levotočivé (L)
- směr otáčení je způsoben
posunem čtyř animálních
(1 a-d ) blastomer vůči
čtyřem vegetálním blastomerám
( 1 A-D )
- pravotočivost je dominantní
nad levotočivostí
- injekce cytoplazmy R-formy
do rýhujícího se vajíčka
L-formy vede ke změně
otáčení L R
Alfred Sturtevant
( Limnaea : 1923 )
Cytoplazma oocytu rozhoduje o směru otáčení ulity
měkkýšů: „pravotočivý“ faktor je dominantní
PRAVÁ MATKA x LEVÝ OTEC LEVÁ MATKA x PRAVÝ OTEC
P L L P
P L
D/D d/d d/d D/D
D/d D/d
D/D D/d D/d d/d D/D D/d D/d d/d
všichni
3 P : 1 L stejně ! 3 P : 1 L
rodiče
(křížení)
generace F1
samo-
oplození
F2
samo-
oplození
F3
P !
normální vývoj
abnormální vývoj
Dědičnost
genů s
maternálním
účinkem
Úlohy genů s maternálním účinkem
• geny odpovědné za iniciaci
antero-posteriorní a dorsoventrální
polarizaci ambrya
• Bicoid mRNA je rozpoznávána
v cytoskeletu svou 3` UTR v
„budoucí“ anterorní oblasti
vajíčka
• Nanos mRNA je rozpoznávána
svou 3` UTR v „budoucí“
posteriorní oblasti vajíčka
• Hunchback a caudal mRNA
jsou rozpoznávány v různých
oblastech embrya
vajíčko drosofily s gradientem mRNA
Paradox hodnoty C: vztah mezi velikostí haploidního genomu, počtem
buněčných typů a morfologickou složitostí organismů
Základní kroky v evoluci rostlin a živočichů
VÝVOJOVÉ PROCESY U ROSTLIN A ŽIVOČICHŮ
zárodečná dráha zárodečné buňky vznikají segreguje od somatické
ze somatických v pozdním vývoji v časné embryogenezi
oplození dvojité ( zygota a endosperm ) jednoduché
haploidní fáze několikabuněčný gametofyt pouze gamety
imprinting ovlivňuje vývin endospermu zásadně řídí embryogenezi
diferencované buňky totipotentní osud progresivní a ireverzibilní
tělní plán založen až při postembryonálním vytvořen již v embryu,
vývinu meristému, vliv prostředí vývojový program determinován
tvorba tvarů podobné vývojové principy včetně specifikace osy, založení
vývojových kompartmentů, homeotické geny zajišťují poziční identitu
morfogeneze buněčný pohyb či lokomoce nejsou, relativní pohyb buněk (gastrulace)
závisí na rovině a rychlosti dělení buněčná migrace (zárodečné buňky)
 rostliny a živočichové jsou složeni z odlišných typů buněk: tyto dvě říše
divergovaly ze společného jednobuněčného eukaryotického předka
 každá říše si musela vyvinout své mechanismy buněčné
diferenciace a komunikace
 základní rysy vývoje rostlin a živočichů jsou společné:
představují jedinou možnou alternativu?
 počet genů je u těchto říší obdobný: jsou homologní i jejich regulační geny
nebo jen vývojové mechanizmy?
 obecné buněčné funkce rostlin a živočichů jsou shodné: struktura jádra,
mitózy, meiózy a základní transkripční a translační mašinérie
 regulace prostorově-časové genové exprese jsou podobné, avšak homeotické
geny kódující proteiny (se srovnatelnými vývojovými funkcemi, jsou odlišné
 některé transkripční faktory mají vysokou AMK-sekvenční homologii
(homeoboxy, MADS boxy), mají však jiné funkce
 řada buněčných procesů včetně receptorů vnějších vlivů a mezibuněčných
komunikací jsou zásadně odlišné
ROSTLINY A ŽIVOČICHOVÉ aneb LOGIKA VÝVOJE
Základní stádia ontogeneze obojživelníků
(De Robertis et al. 1990)
oplozené 2-buněčné stádium midblastula časná gastrula pozdní gastrula
vajíčko (90 min) (4tis. buněk, 7 h) (20tis. buněk, 9h) (12h)
animální pól blastocoel
vegetální pól blastopor blastopor
ektoderm
mesoderm
endoderm
časná neurula časná neurula pozdní neurula vylíhnutý pulec dospělá žába
(150tis. buněk, 20h) (500tis. buněk, 3d) (12 měsíců)
střevo střevo
neurální neurální uzavírající se
destička destička neurální destička
Střídání
generací u
krytosemen-
ných
rostlin
ZYGOTA
embryo
(uvnitř semene
a plodu)
rostlina
(stonek, kořen, listy)
květ
samčí tyčinky
samičí pestíky
MEIOSA
mega- mikro-
sporogeneze
haploidní spory
spermie
SPOROFYT ( 2n )
maternální
integumenty
DVOJÍ
OPLOZENÍ
SAMIČÍ GAMETOFYT SAMČÍ GAMETOFYT
buňka
vaječná
( zygota)
centrální jádro
( endosperm)
GAMETOFYT ( n )
Epigenetická tvorba tvarů v průběhu vývoje
(i) úloha vnějších (fyzikálních) faktorů
(ii) pozice maternálních determinant mozaikový vývoj
- asymetrický transport cytoplazmatických determinant
z maternálního vaječníku
- ooplazmatická segregace (proces třídění a vnitřní strukturalizace po oplození)
(iii) buněčné interakce (concerted behaviour) regulativní vývoj
komunikace buněk s okolními buňkami vede ke koordinované tvorbě
struktur a tvarů
Vývojový osud, schopnosti a určení
( fate, potency, and determination )
Vývojový osud (fate) a schopnost (potency)
Buněčný osud se vztahuje ke strukturám, které se „normálně“
vytvoří z embryonální buňky.
Schopnost jsou všechny možné vývojové osudy určité
buňky ve specifickém stádiu vývoje organismu.
Schopnost je totožná s osudem pro buněčně autonomní
mechanismus determinace (tj. mozaikový vývoj).
Schopnost „překonává“ osud u buněčně intaktivních mechanismů
determinace (tj. regulativní vývoj).
Vývojové extrémy :
mozaikový a regulativní vývoj
Mozaikový vývoj nastává, když se
organismus vyvíjí, jako kdyby jeho
blastomery tvořily prvky skládačky (puzzle),
každý s prederminovaným osudem.
Mozaikový vývoj se
uskutečňuje prostřednictvím
asymetricky lokalizovaných
cytoplazmatických
determinant.
asymetrická lokace
dělení buňky
odlišné dceřinné
buňky
Vývojové extrémy :
mozaikový a regulativní
Regulativní vývoj osud
blastomer je
flexibilní, závisí na
lokaci buněk,
organizmus je schopen
kompenzovat ztrátu či
dislokaci blastomer.
Regulativní vývoj závisí na
mezibuněčných komunikacích.
Mezibuněčná komunikace je základem
embryonální indukce :
jedna buňka dává instrukce jiné buňce
k dosažení určitého vývojového osudu.
Komunikace mezi buňkami může být
dosaženo difúzibilními signály, přímým
kontaktem mezi membránovými proteiny
nebo tranzientními póry.
buněčné signály
difúze
přímý kontakt
signál
druhý posel
buněčné spoje
Mozaikový vývoj se odehrává buněčně-autonomně;
regulativní vývoj je buněčně-interaktivní.
Buněčně autonomní a buněčně
interaktivní vývojové mechanismy
Prakticky všechny organismy se vyvíjejí za kombinace
mozaikového a regulativního typu vývoje.
Základní termíny vývoje
Typ buněčně buněčně
determinace : autonomní interaktivní
__________________________________________
Mechanismus : morfogenní indukce
determinanty
Typ vývoje : mozaikový regulativní
Invariantní schéma buněčného dělení: dospělec má vždy 959 buněk.
Caenorhabditis elegans : model mozaikového vývoje
Časný vývoj savčího embrya
je vysoce regulativní
Savčí embryonální buňky vykazují flexibilitu ve výběru
osudu (buněčného fenotypu) podle potřeb embrya.
Tvorba chimér a monozygotických dvojčat je jasnou
demonstrací regulativního typu vývoje.
Alternativní cesta tvorby chimér :
inkorporace cizích embryonálních
kmenových buněk
… je také finálním krokem
při konstrukci geneticky
modifikované myši.
ES buňky s žádanou mutací
injekce do blastocysty
chiméra může předávat mutaci
Mapy vývojového osudu (fate mapping)
„Osudová“ mapa ukazuje pozice (locations) a výsledné
tkáně (derivatives) embryonálních buněk.
„Osudové“ mapy mají (alespoň) určitý stupeň přesnosti pouze
u organismů, které vykazují mozaikový typ vývoje.
laterální pohled dorzální pohled
„Osudové mapování“ s pomocí vitálního barvení (fluorescence)
Blastomera Xenopus C3 dává vznik mezodermálním buňkám
podél jedné strany pozdního embrya (tailbud stage).
Vývojové schopnosti (potency) a určení (determination)
Schopnost je v průběhu vývoje stále omezována. Když se schopnost
buňky již rovná jejímu osudu, buňka je vývojově určena
(determinována).
Základní typy vývojových schopností :
totipotentence,
pluripotence a
determinace (unipotence).
Pochopení vývojových
schopností a určení má zásadní
význam pro klonování savců.
První klonovaná kočka
(Science 295:1443, 2002)
Spemann a
Mangoldová
(1924):
progresívní
determinace v
embryogenezi
obojživelníků
stav nedeterminován
stav již determinován
VEMI ČASNÉ neurální
GASTRULY recipient destička
donor
POZDĚJŠÍ
GASTRULY
druhá neurální destička
epidermis
Progresívní
determinace
u drosophily
časné stádium
není
determinované
donor : recipient :
genotyp A genotyp B
osudová
mapa
n o r m á l n í v ý v o j
Syncyciální
blastoderm:
Buněčný
blastoderm :
pozdější
stádium je
determinované
ablace buněk ektopická exprese
způsobí defekt v A5 „genů A5“ na hlavě