… v hlavní roli červi: hlístice 0,01 mm 0,01 mm 0,5 mm dospělec oplozené vajíčko rýhování embryogeneze vylíhnutí hodiny po oplození Nobelova cena 2002 za fyziologii a lékařství za objevy genetické regulace orgánového vývoje a programované buněčné smrti … na modelu Caenorhabditis elegans Sydney Brenner (1927, JAR) Robert Horvitz (1947, USA) John Sulston (1942, UK) g – gonáda h – hypodermis i – střevo m – svaly nc – nervová trubice Anatomie C. elegans 1. malá, snadno se kultivuje (živí se E. coli) 2. jednoduché tělo: 959 tělních buněk , 1031 u 3. dobře diferencované tkáně včetně nervové soustavy 4. průhledné tělo po celý životní cyklus 5. krátká generační doba: 3,5 dne při 20oC 6. invariantní vývoj a anatomie 7. samooplození (a částečně křižitelná) 8. malý, již sekvencovaný genom ( ~108 bp = 100 Mb = 0,1 pg ) Osm dobrých důvodů, proč studovat C. elegans – model mozaikového vývoje Buněčná genealogie C-elegans tkáně jsou polyklonálního ůvodu hypodermis hltan nervové buňky (389) hltan střevo hypodermis svaly (20) svaly žlázy nervové buňky nervové buňky (47) (80) zárodečné buňky svaly (20)  základní životní cyklus je diploidní  6 vazebných skupin, odpovídá to 6 chromosomům v haploidní sadě: 5 autosomů a 1 pohlavní chromosom X  hermafrodit má dva chromosomy X v diploidní buňce  hermafrodit tvoří ~ 300 spermií, pak tvoří oocyty  meiosa u hermafrodita vytváří gamety s jednou sadou autosomů a jedním X  samooplození obvykle dává vznik embryu 2 X : 2 A = hermafroditu Základní genetická characteristika C. elegans Caenorhabditis elegans : vznik a dědičnost pohlaví XX XX XO XX XO Pro genetiku jsou potřební samečci  Příležitostná ztráta chromosomu X v průběhu meiosy u hermafrodita dává gamety bez X. Frekvence asi 1 na 500 meios. Když je gameta oplozena, výsledkem je diploidní živočich pouze s 1 X.  Jedinec červa pouze s jedním chromosomem X v diploidní buňce se vyvíjí jako sameček.  Žádný chromosom Y u C. elegans není, samečka značíme XO.  V meiose u samečka segreguje jediný chromosom X a tvoří se dva druhy spermií: s jedním chromosomem X resp. žádným:  Křížení samečka s hermafroditem dává v potomstvu stejné počty samečků a hermafroditů. male sperm oocyte 1X, 1A 1A 1X, 1A X0, AA XX, AA male hermaphrodite oocyty hermafrodita spermie samečka Mutageneza C. elegans + / + + / m m / m+ / m+ / + Po F1 F2 mutagen: chemický, př. EMS fyzikální, př. g - záření aplikace na Po když zárodečná linie má mnoho mitotických buněk: larva ve stádiu L4 1/4 samooplození dává vznik homozygotům v F2 Jaké typy mutantů můžeme mít ?  morfologické př. Dumpy (Dpy) – krátké, tlusté tělo Long (Lon) – delší než WT  chování (pohyb) př. Uncoordinated (Unc) Roller (Rol)  heterochronní př. Cell Lineage Abnormal (Lin)  letální př. Lethal (Let)  sexuální transformace př. Masculinizing (Tra) Feminizing (Fem) Účinek genů řídících programovanou buněčnou smrt u hlístice : geny cell death ced-3 a ced-4 (produkující cytotoxiny) jsou řízeny (inhibovány) genem ced-9 - jestliže je tento gen aktivní, buňka se nepodrobí apoptóze buňka určená k zániku indukce apoptózy pohlcení fagocytózou, degradace buňky i jádra buňka „hrobník“ nukleáza larva anterior posterior Buněčný osud hlístice podél antero-posteriorní osy je určován jediným (kolineárním) shlukem Hox genů - s homologiemi ke čtyřem homeotickým genům z komplexu Antennapedia mouchy nemá článkované tělo! Časování vývojových procesů, zapínání a vypínání genů v závislosti na koncentraci a čase, prahové hodnoty HETEROCHRONNÍ GENY HETEROCHRONNÍ MUTACE model řízení časového vývoje larvy C-elegans specifická stádia larválního vývoje jsou určována hladinou proteinu lin-14 koncentrace lin-14 vysoká střední nízká časový gradient lin-14 je výsledkem transkripční represe lin-14 proteinem lin-4, začínající při časném vývoji larvy standardní typ represe lin-4 lin-14 mutace, „získání“ funkce, nebo „ztráta“ lin-4 funkce lin-14 mutace, „ztráta“ funkce Buněčná genealogie u WT a heterochronních mutantů C-elegans standardní typ „předčasný“ mutant „opožděný“ mutant lin-14 (lf) ln-14 (gf ) mutace „ztráta funkce“ mutace „získání“ funkce klíč : buněčná smrt larvální stádia (1-4) předčasná tvorba specifických linií retardace vývoje linií, opakování vývojových typů Centrální dogma molekulární biologie ( Francis Crick ) transkripce translace DNA (skladování informace) RNA (přenašeč informace) proteiny (výkonná mašinerie buňky) Tento model má přinejmenším dva nedostatky : - nebere v úvahu mnoho faktorů, které modifikují genovou aktivitu v průběhu transkripce a translace - DNA a RNA nejsou jedinými skladníky a přenašeči informace (i) RNA-dependentní RNA polymeráza ss RNA ds RNA (ii) Dicer : ribonukleáza ds RNA malé ds RNA ( ~ 22 nt ) (iii) Argonaut (RISC) - proteiny ribonukleázového komplexu : štěpení (endogenní homologní) mRNA Craig Mello, Andrew Fire (Carnegie Institution 1998) 2006: NOBELOVA CENA ZA FYSIOLOGII A LÉKAŘSTVÍ SELEKTIVNÍ UMLČOVÁNÍ GENŮ PROSTŘEDNICTVÍM RNA INTERFERENCE (1)(2) (3) Baktérie exprimující dsRNA GFP-exprimující červi …. ….pojídající standardní baktérie ….pojídající baktérie exprimující GFP dsRNA RNAi by ingesting dsRNA! Timmons and Fire - Nature 295: 854, 1998 PostTranskripční genové umlčování a RNA interference - spojitost ? David Marjori Baulcombe Matzke (Norwich) (Vienna) „PostTranskripční genové umlčování se vyskytuje u rostlin a hub transformovaných cizí nebo endogenní DNA a má následek v redukované akumulaci RNA molekul se sekvenční podobností k introdukované molekule nukleové kyseliny.” Hamilton and Baulcombe, Science 286: 952, 1999 KOMPENZACE DÁVKY GENŮ VÁZANÝCH NA CHROMOZOM X - Caenorhabditis - Drosophila - savci KOMPENZACE DÁVKY GENŮ (hermafrodit) C-elegans Vývojové dráhy vedoucí k determinaci pohlaví a X - dávkové kompenzaci u C-elegans XSE (X-signal elements) a ASE (autosomal -signal elements) regulují hladinu XOL-1, která řídí kaskádu k faktoru SDC2. - vysoká hladina HER-1 vede k samčí pohlavní dráze (potlačení samičí dráhy) - nízká hladina HER-1 umožňuje tvorbu obou pohlavních orgánů aktivace kondenzinových komplexů snižujících expresi obou X (DCcomplex) Dosage Compensation Complex zprostředkovává down-regulaci obou chromozomů X a autosomálního lokusu HER-1 lokusu v somatických tkáních hermafrodita DCC komplex se vytváří v XX-červech, váže se a šíří po X-chromozomech, redukuje expresi X-genů ~ 2krát, po vazbě na autosomální HER-1 redukce 20násobná. Regulace aktivity X chromozomů v průběhu životního cyklu u XX – hermafroditů C-elegans Aktivita X-chromozomů je regulována v různých vývojových stadiích a v různých tkáních odlišnými mechanismy: imprintovaná inaktivace paternálního X v časném embryu (I), kompenzace dávky genů v somatických tkáních pozdnějšího embrya a dospělce (DC), a meiotic silencing v zárodečné linii (MES). Meiotic silencing of unpaired DNA v zárodečné linii inaktivuje jediný chromozom X u X0 samečků v časném embryu je inaktivován paternální X (imprinting) dávková kompenzace = Epigenetické regulace chromozomu X v průběhu vývoje zárodečné dráhy: červeně jsou markery inaktivity (H3K9metyl a 27metyl), zeleně markery aktivity (H3K4metyl). Spermie obou pohlaví tedy získávají odlišnou epigenetickou informaci!!! odlišné Imunobarvení spermií od hermafrodita a samečka Modifikace chromatinu spermií u hermafrodita resp. u samečka jsou odlišné Modely prezentující, jak se „silencing“ (proteinové) meiotické komplexy (MES) podílejí na umlčování chromozomu X v zárodečné dráze MES-2,3,6 se koncentrují na marker represe (H3K27metyl) na X a znemožňují vazbu MES-4 MES-4 se koncentruje na odlišný chromatinový marker (H3K36metyl) na autozomech, čímž brání vazbě represoru Proč máme rádi (červy) PLOŠTĚNKY Ploštěnci (Platyhelminthes), ploštěnky (Turbellaria) - první triblastičtí, bilaterálně souměrní (planární, obvykle trikladističtí sladkovodní) živočichové s diferencovanými orgány (tj. mezi nezmarem a hlísticí) - model regenerační morfalaxe (tj. asexuální reprodukce) - model studia kmenových buněk (neoblastů) - nemají zárodečnou dráhu, ale funkční gen Vasa - hermafroditismus a štěpení, resp. sexuální a asexuální (chromosomálně-podmíněné) klony - znovuobjevení historického modelu regenerace (Darwin, Morgan) - model vývoje nervové soustavy (úloha fibroblastového růstového faktoru – úloha genu nou-darake) - photosensing system (negativní fototaxe) a úloha mozkových ganglií - model psychologie - jednoduchých podmíněných reflexů - model allometrie (regulace velikosti a proporcí těla) Regenerace hlavy u ploštěnky Dugesia dorotocephala amputace 1 den poté 2 dny 3 dny 4 dny 5 dnů 7 dnů extracelulární epitel matrix buňky mezenchymu odvozené z neoblastů neoblasty Dendrocoelum Schmidtea lacteum mediterranea kopulační aparát hltan hltan plaménkové fotoreceptory exkreční buňky senzorové neurony mozkové uzliny ovária žloutek příčné spoje nervové svazkyanteriorní větev gastrovaskulární systém posteriorní větve testes Vizualizace trávicí a nervové soustavy ploštěnky požití fluoreskujícího latexu nervový systém vizualizován protilátkou vůči neuropeptidu cerebrální ganglia nervové provazce příčné spojové neurony 1 mm2 krmení („growth“) hladovění („degrowth“) Regulace proporcí těla podle dostupné potravy - allometrie Antero-posteriorní specifikace je řízena homeotickými geny Anatomie ploštěnky Obnovení tělní polarity je řízeno gradienty morfogenů Regenerace dvojitého anteriorního jedince z krátkého fragmentu („ztráta či chyba polární paměti“) Transplantace druhé hlavy vede k potlačení regenerace amputované první hlavy (cf. nezmar) – tvorba hlavového inhibitoru ? Detekce replikace DNA s pomocí digesce BrdU - dělí se pouze neoblasty A) Phagocata sp. B) Girardia dorotocephala C) Schmidtea meditorranea 0,3 mm 100 umanteriorní blastéma posteriorní blastéma Akumulace nově se replikujících (dělících) buněk – neoblastů v oblastech regenerační blastémy 3 dny po amputaci anterioru či posterioru ploštěnky ( značení a detekce BrdU ) Ploštěnka Schmidtea mediterranea pohlavní kmen nepohlavní kmen (aberace) Whole – mount in situ hybridizace s cDNA sondami Ingesce bakteriálně exprimované dvouvláknové RNA inhibuje genovou expresi u ploštěnek Escherichia coli cDNA T7 T7 ds RNA + játra, agaróza a barvení potravy E. coli hltan ds RNA umělá potrava - mikroinjekce ds RNA či prosté krmení ds RNA produkujícími bakteriemi vede (stejně jako u Caenorhabditis elegans) k inhibici příslušných genů - inhibice persistuje po regeneraci, což umožňuje analýzu fenotypů - metoda transgenoze dosud nebyla u ploštěnek zvládnuta, ds RNA je tedy hlavním nástrojem identifikace funkce genů Využití RNA interference k identifikaci genů vyžadovaných k regeneračním procesům introdukce specifické ds RNA ampu- tace ztráta schopnosti regenerace dvojitý anterior dvojitý posterior Pijavenky (Bdelloidea), kmen Vířníci (Rotatoria) asexuální červi („EVOLUČNÍ SKANDÁL“, Maynard Smith) Bdelloid rotifers vířníci - mikroskopičtí mnohobuněční živočichové, červi (100µm až 1mm) - velmi početní v mokrých stanovištích - anhydrobióza: klidové stádium a šíření - schopné fixovat fragmenty DNA (horizontální genový přenos) - obligátní partenogeneze (samečci nejsou) - asi 450 morphologicky rozlišitelných druhů - radiorezistence (vysoká účinnost reparací) Vířníci neznají genetickou rekombinaci, přesto se podrobují speciaci díky odlišné selekci a geografické izolaci. Dnes existuje asi 400 druhů starých přes 40 milionů let. Určitou genetickou variabilitu zajišťují kromě přirozené mutageneze i restrukturalizace genomu v průběhu anhydrobiózy (včetně fixace cizí DNA). Bdelloid rotifers vířníci